疾病的细胞机制：细胞凋亡与疾病

在人体内不断有细胞死亡。有人做过一个大概统计，人的一生死亡的细胞重量远远超过人的自身重量。例如， RBC 的寿命只有 120 天，血小板只有 7-10天。但是细胞的死亡不是只有坏死一种模式，目前认为至少有二种模式：

（一）细胞死亡的模式

1．细胞坏死（ Necrosis ）

细胞坏死通常是由严重损伤因素导致的，正常组织细胞不发生细胞坏死。它的特点：在～过程中无新蛋白合成、不耗能、 DNA 呈弥漫性降解。

2．细胞凋亡（ apoptosis ）

是指在特定时空中发生的，受机体严密调控的细胞“自杀”现象。或换句话讲：是细胞内预存的死亡程序被体内外因素触发而导致的细胞生理性消亡。

【凋亡的生理学意义】

（1）确保组织器官正常发育、生长

在机体的发育、生长过程中，凋亡可以清除多余的和失去功能的细胞，所以，在器官和组织形成中发挥了重要的作用。例如，在人胚胎肢芽发育过程中，通过凋亡使指间组织细胞通过凋亡被逐渐消除，形成指间。

（2）维持内环境稳定

如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除话，就会干扰内环境稳定。例如，突变细胞不及时清除会导致肿瘤发生。

（3）发挥积极的防御功能

例如，当细胞受到病毒感染时，受感染的细胞可以通过凋亡来阻止病毒的增殖，或通过 DNA 的降解，把病毒的 DNA 进行分解。
通过上述可以看出，一旦机体的凋亡失控可能导致疾病发生。

（二）细胞凋亡的过程与变化

1.细胞凋亡的过程

细胞凋亡的过程大致可分为四个阶段：

（1）凋亡信号转导 当细胞内外的凋亡诱导因素与被作用的细胞受体结合后，细胞产生复杂的生化反应，并形成与凋亡有关的第二信使：cAMP 、Ca²⁺ 、神经酰胺等信号分子形成死亡信号。

（2）凋亡基因激活 调控的凋亡基因在接受死亡信号后，开始按预定程序启动，并合成执行凋亡所需的各种酶和相关物质。

（3）凋亡的执行（共同通路）凋亡的主要执行者有两类酶：核酸内切酶（ endogenous nuclease Dnase ）—彻底破坏细胞的生物命令系统； Caspases 3 —细胞的结构全面解体。

（4）凋亡细胞的清除 凋亡后细胞可以被邻近巨噬细胞分解。

2．凋亡时细胞的主要变化(详见病理学部分凋亡)

凋亡作为一种生理性、主动的细胞死亡，它的死亡过程和形态变化与细胞坏死有显著的差别。

（1）形态学改变

① 实体细胞凋亡时，其表面微绒毛消失，与周围细胞脱接触。

②凋亡细胞胞浆开始脱水产生空泡，并与胞膜融合，出现胞膜空泡化（ blebbing ）。

③因水份丧失出现细胞固缩（ condensation ）、核固缩和发芽。

④ 在细胞凋亡末期，碎裂的核物质由一薄层胞浆包被，形成所谓的凋亡小体（ apoptotic body ）。

在凋亡的整个过程中，没有细胞的内容物的外漏，因此也不伴有局部的炎症反应。

（2）生化改变

① DNA 的片段化 由于核酸内切酶激活，基因组的 DNA 在核小体连接区发生非随机性降解，产生寡核小体片段，其大小相当于核小体（ 160 ～ 200bp ）的倍数。在琼脂糖凝胶电泳中可见特征性的“梯”状（ ladder pattern ）条带。

② 钙超载 在 80 年代人们发现用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现凋亡的细胞内游离 Ca²⁺ 浓度显著上升。用 Ca²⁺ 载体 A23187 ，人为提高 B 淋巴细胞内 Ca²⁺ 的水平，可诱导 B 淋巴细胞的凋亡。而用钙络合剂降低细胞内水平，能阻止凋亡发生。后发现凋亡细胞存在钙超载现象。 Ca²⁺ 在细胞凋亡中充当凋亡信号传递的角色。

③ 内源性核酸内切酶激活 在凋亡时，细胞核内的核酸内切酶常常被激活，从无活性状态变成有活性，多数核酸内切酶是一种二价金属离子依赖性酶， Ca²⁺ /Mg²⁺ 可增加酶的活性，而 Zn²⁺ 能抑制它的活性。当然在某些细胞内也存在非二价金属离子依赖性核酸内切酶。 Zn²⁺ 也不能抑制其活性。

除了上述外，还有可出现细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻（由细胞膜内侧转向膜外侧）、 caspase 激活、蛋白激酶 C （ PKC ）活化等。

3．诱导细胞凋亡的相关因素

影响细胞凋亡的因素

（三） 细胞凋亡的发生机制

细胞凋亡是一个复杂的过程，根据对 Caspase 依赖程度，可以把细胞凋亡过程分为： Caspase 依赖和非 Caspase 依赖两种。例如，细胞内钙超载也是细胞凋亡的重要机制，如 TNF ，抗 CD3 抗体、 TCDD 等引起细胞凋亡是钙依赖过程。凋亡发生时胞浆内钙浓度显著增加，并通过 4 个途径引起和促进细胞凋亡。

1.Caspases

（1）概念 Caspase 属于半胱氨酸蛋白酶家族，有 14 个成员，分别命名 caspase 1-14 。

（2）分类

1） Caspase ：ICE (Inteleukin-1β-converting enzyme) 亚家族（ -1,-4,-5 ）不参与细胞凋亡； ced-3 亚家族（-2,-3,-6,-7,-8,-9,-10）与细胞凋亡。 其信号通路可以分为 内通路和外通路和共同通路。

2） ced-3 亚家族：上游（如 caspase-2,-8 ,-9, -10 ）（ 启始 Caspases ） 下游（如 caspase-3,-6,-7 ）（共同通路）（ 效应 Caspases ） 。

（3）结构与活化

Caspases 酶原包含三个结构域： NH2 末端结构域（ Prodomain ）、约 20KD 大亚基和约 10KD 小亚基。酶原的激活需要在大小亚基和 N 末端结构域内进行切割，然后大小亚基形成异源二聚体，并进而形成具有两个独立活性位点的四聚体，这就是被激活的酶。

（4） 特点

活化的 Caspase 具有严格的底物特异性，能特异性剪切天冬氨酸残基后的肽键（ Asp-X ）。使细胞凋亡过程中发生专一性蛋白质降解，导致其功能的丧失或结构变化。

（5）执行者 （ Executioner ）底物降解

活化的 Caspase 可以对细胞凋亡抑制蛋白、细胞结构蛋白， DNA 修复、 mRNA 拼接和 DNA 复制等相关核酸酶等进行降解。通过有效的降解，活化的 caspase 能切断凋亡细胞与周围细胞的联络、重组细胞骨架、关掉 DNA 复制和修复机器、破坏 DNA 和核结构，在细胞凋亡过程中起着重要作用。所以有人称 Caspase 是凋亡的执行者 （ Executioner ）

2.死亡受体（ death receptor, DR ）通路 （外通路 ）

（1）概念 死亡受体是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。它包括 TNFR 、 Fas 、 DR3 、 DR4 、 DR5 等。 这些受体除了具有富集半胱氨酸的胞外结构域外，其胞浆区内包含由 60-80 个氨基酸组成的死亡结构域（ death domain, DD ）。后者能传递死亡受体诱发的一系列细胞凋亡信号，尤其是活化 caspase。

（2）通路机制

例如， Fas 配体（ Fas L ）以同三聚体形式与 Fas 的 DD 交联、结合成簇。之后，与相应的伙伴蛋白（ adaptor ）的 DD 结合，其最重要的伙伴蛋白是 FADD （ Fas-associated death domain ）。 FADD 不仅通过其分子中的 DD 结构与 Fas 结合；同时， FADD 通过其死亡效应结构域（ death effector domain ， DED ）与 caspase 的 DED 相互作用。 TNFR1 与 TRADD 、 FADD 结合。最后，导致 caspase-8 形成寡聚体，并且自身活化。活化的 caspase-8 使 caspase -3 活化，细胞凋亡。

但是死亡受体中的 TNFR1 和 DR3 被激活后，还可以通过激活 NF- κ B 和 c-Jun N 端激酶（ JUK ）信号转导通路产生对细胞的保护作用和抗凋亡的作用。

3.线粒体途径（内通道）

是指细胞在应激或受到细胞毒、化疗药物（ 凋亡诱导信号） 作用时，会导致线粒体的破坏， 使线粒体内外膜之间通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore,MPT）开放，造成线粒体膜的通透性增加、线粒体肿胀、线粒体内膜的跨膜电位（△Ym）下降。受损的线粒体将细胞凋亡的启动因子—细胞色素 C 释放到胞浆中。在 ATP 的参与下，胞浆内细胞色素C（cyto-c）与Apaf-1 结合并使之活化。后者经其 CARD （ caspase recruitment domain ）结构域与 caspase-9 前体的原结构域结合，导致 caspase-9 的自身剪切和活化。细胞色素C、Apaf-1和 caspase-9 前体组成的全酶（ holoenzyme ）复合物称为“凋亡体”（ apoptosome ）。活化的 caspase-9 使caspase-3 活化。

除了细胞色素 C 外，线粒体也释放其它凋亡诱导分子，如：凋亡诱导因子（ apoptosis-inducing factor, AIF ）也能直接使 caspase-3 活化。

4.活化 caspase-3 （共同通路）（凋亡执行）

（1）使 caspase-6 活化，活化的 caspase-6 可以使 caspase-7 活化，活化的 caspase-7 具有剪切 CAD 抑制物（ inhibitor of CAD, ICAD ）转变成 caspase 活化的 DNA 酶（ CAD ）， CDA 进入细胞核内降解 DNA ，细胞发生凋亡。

（2）活化的 caspase-3 可以使 caspase-9 活化，形成正反馈。

（3）活化的 caspase 具有剪切细胞内的结构蛋白，细胞发生凋亡。

（四）细胞凋亡的调控机制

目前，已知与凋亡相关的调控基因有 20 多种，这些基因可以分为三类：

1）抑制凋亡基因：如 BCL-2 、 BCL-X L 、 A1/Bfl-1 、 BCL-w 、 BCL-G 和 MCL^-1 等。

2）促凋亡基因：如 Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、BCL-B、BCL-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa 等。

3）双向调控基因： c-myc 、Belx。

在细胞凋亡的调控基因中， BCL-2 基因家族和 p53 基因是研究最深入、广泛的凋亡的调控基因。

1.BCL-2 基因家族（癌基因）BCL-2 是抑制凋亡的癌基因。其抑制凋亡的机制：

（1） BCL-2 （ BCL-X L ） 能够抑制线粒体 MPT 开放，进而阻止线粒体内细胞色素 C 和 AIF 的释放。

（2） BCL-X L 也能特异地结合细胞色素 C ，从而降低胞浆内细胞色素 C 的可利用性。

（3） BCL-X L 能够结合和灭活 Apaf-1 ，阻断对 caspase-9 活化。

相反，Bik（促凋亡基因）可以通过与 BCL-2 或 BCL-X L 结合，使 Apaf-1/ caspase-9 复合物的游离和 caspase-9 的活化。

2.P53 基因（抑癌基因）P53 基因也是非常重要的促凋亡基因。其促凋亡机制：

（1） p53 通过与 BCL-2 基因相互作用，下调 BCL-2 的表达。

（2） P53 能够诱导线粒体和死亡受体介导的细胞凋亡的靶蛋白表达。

（3） P53 诱导定位于线粒体的凋亡相关蛋白（ BAX 、 NOXA 、 PUMA 和 P53AIP1 蛋白）表达，触发细胞色素 C 的释放和 caspase 的活化。

（4） P53 诱导死亡受体 FAS 的表达。

（5） P53 能使死亡受体再定位到细胞膜。

（五）细胞凋亡异常和疾病

细胞凋亡是机体维持细胞群体数量稳态的重要手段，细胞凋亡异常可以导致疾病的发生。

1．细胞凋亡和肿瘤

目前认为，细胞不死是多数恶性肿瘤发病的另一个途径。恶性肿瘤细胞凋亡抑制的发生机制几乎涉及细胞调控信号途径的所有方面。

（1） BCL-2 基因过表达

85% 滤泡状和 20% 弥漫性 B 细胞淋巴瘤存在染色体 t （ 14;18 ）易位。该易位导致 BCL-2 基因受到免疫球蛋白基因增强子控制而高表达。在临床上许多肿瘤如乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在 BCL-2 高水平表达，但机制不清。

（2） P53 基因缺失或突变

由于调节 P53 蛋白的稳定性、细胞内定位或（和） P53 活性的机制发生异常，使 P53 表达或功能存在缺陷，出现 MDM-2 功能抑制，导致细胞凋亡受到抑制。所以， 50% 以上的恶性肿瘤中存在 P53 异常。

（3）病毒的癌基因

HBV 编码的 HB X 蛋白是 caspase-3 的强效抑制物，所以与肝癌发生密切相关。

（4）异常融合蛋白

慢性髓细胞性白血病（CML）和某些急性淋巴细胞性白血病存在特异的染色体易位 t （ 9 ； 22 ），即所谓的 Ph 染色体。该易位导致 Bcr-abl 融合基因的表达和产生 p210 Bcr-abl 蛋白质。这种融合蛋白能降低细胞凋亡速率，导致 CML 髓系祖细胞的克隆扩增。

细胞凋亡抑制除了参与肿瘤的发病过程，也涉及癌细胞的转移发生。