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免疫组织与细胞化学技术简介

一、原理与方法

免疫组织与细胞化学技术(immunohistochemistry and immunocytochemistry technique)是从组织与细胞化学方法衍生出来的。是在单克隆抗体技术产生后,利用免疫学原理,将抗原抗体反应应用于组织细胞化学而进一步通过级连放大,增加敏感性。最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原(蛋白 多肽、酶)等多种基因产物的特异方法。在病理学外检工作中可用于对不同来源,HE难以诊断的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。

其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原-抗体复合物”的化学反应,以检测组织或细胞内抗原(或抗体)的技术。

二、免疫组织化学技术的主要步骤与常用标记物

(一)主要步骤

①提取抗原;②用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体) 或免疫动物(鼠)后,用杂交瘤技术制备单克隆抗体;③纯化抗体;④抗体标记组织切片;⑤染色反应;⑥观察结果。

(二)常用标记物

1.酶 为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件:

2.荧光素 指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗达明(TRITC)。

3.生物素 其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。

4.金属标记物 如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。

三.常用免疫组织化学染色方法

(一)直接法

将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一抗体上,以检查相应的抗原。直接法具有特异性强的优点,但敏感性差,耗费抗体多。

(二)间接法

先用荧光素或酶标记第二抗体,一抗为特异性抗体, 二抗仅有种属特异性。

特点: ⑴ 预先标好二抗,较方便;⑵ 比直接法敏感,但仍差。

(三)PAP法与双PAP法:即过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(Peroxidase Antiperoxidase Complex, PAP)

先将过氧化物酶(HRP)免疫兔/羊/鼠,制成兔/羊/鼠抗HRP;然后再与HRP结合,形成一个稳定的多角形结构(PAP)。
特点:①敏感性较高;②背景染色低(相对);③双PAP敏感性更高,但背景相对较重。

(四)ABC法 即卵白素-生物素过氧化物酶复合物法(Avidin Biotin-peroxidase Complex,ABC)

利用卵白素与生物素特有的高度亲和力,先将生物素与酶结合形成生物素化HRP,再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合,形成一个复合物;同时先将二抗生物素化。

1.如将卵白素换成链霉亲和素,则为:SABC法:(StreptAvidin Biotin-peroxidase Complex)

2.将链霉亲和素和生物素先连结起来,则称:LSAB法:labelled StreptAvidin-Biotin

3.用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶,则为:S-P法:(StreptAvidin Peroxidase conjugataed method);若用碱性磷酸酶标记链霉卵白素则称SAP法。若分别用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素,则称DS法。

特点: ①敏感性高,(比PAP高8~40倍);②背景淡,链霉亲和素更好;③方法较简便,时间较短;④应用范围广,也可用于原位杂交和免疫电镜。

四.免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项

1. 正确设置免疫组织化学的对照

对照原则:首先对照第一抗体;替代对照要注意相同的原则;阳性结果阴性对照,阴性结果阳性对照;染色清晰,定位准确(左、中、右图)。

免疫组织化学
 左图:食管鳞癌 E-cad膜强阳性  中图:神经胶质细胞GFAP胞浆胞膜阳性  右图:肺硬化性血管瘤 TIF-1核阳性

阴性对照

⑴ 空白对照:用PBS置换第一抗体;

⑵ 血清替代对照:用同种动物的正常血清代替第一抗体;

⑶ 抑制对照:用未标记的抗体先和相应的抗原结合;

⑷ 吸收对照:用纯化的抗原对抗体先行吸收;

阳性对照:用已知或已被实验证明为阳性的组织;

自身对照:利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。

2.假阳性反应:

⑴ 非特异性反应:边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等;

⑵ 内源性过氧化物酶:红细胞、炎细胞、退变坏死细胞和某些腺上皮分泌物,以及某些富含过氧化物酶的组织,如脑、肝等;

⑶ 抗体的交叉反应:抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分;

⑷ 试剂浓度过高或失效。

3.假阴性反应:

⑴ 组织固定不当或固定时间过长;

⑵ 抗体效价过低或久置失效;

⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔;

⑷ DAB或H2O2的浓度不当。

五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用

(一)在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因

1.在常规病理活检中,通常有5~10%的疑难病例不能明确诊断。

2.形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源(如未分化癌和恶性淋巴瘤)因而难于识别,给治疗带来困难。

3.一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征,因而无法确定其原发病灶(如甲状腺癌和前列腺癌)。

4.通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协助识别肿瘤的良恶性。

(二)各种不同组织及其肿瘤常见的标记物

免疫组织化学最突出的优点是能在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分,由于其方法简便且可重复性强,目前已得到广泛的应用,并正继续向着更微细、更精确的原位分子杂交和免疫电镜方向发展,向着分子病理学的领域推进。

各种不同组织及其肿瘤常见标记物
标记物 抗体 常见阳性肿瘤
上皮标记 广谱细胞角蛋白(CK/AE1/AE3) 上皮性肿瘤
上皮细胞膜抗原(EMA) 上皮源性肿瘤,尤其是低分化腺癌
软组织标记 广谱肌动蛋白(Actin) 肌源性肿瘤
结蛋白(Desmin) 肌源性肿瘤(肌细胞分化最早的标记)
波形蛋白(Vimentin) 间叶源性肿瘤
神经内分泌标记 突触素(SY) 嗜铬细胞瘤、节细胞神经瘤、APUD瘤
胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 星形胶质细胞瘤
S-100蛋白 神经源性肿瘤,恶黑、脂肪肉瘤
神经元特异性烯醇化酶(NSE) 神经内分泌肿瘤(特异性较差)
淋巴造血组织标记 白细胞共同抗原(LCA) 造血组织肿瘤(造血细胞的特异性标记)
T细胞CD3 T细胞淋巴瘤
B细胞CD20 B细胞淋巴瘤
细胞周期素标记 周期素B1(Cyclin B1) G2期和M期
周期素D1 (Cyclin D1) G1期进入S期重要调控因子
周期素D2(Cyclin D2) G1期进入S期重要调控因子
Ki-67 Antigen S、G2、M期(G0期缺如)
增殖细胞核抗原(PCNA) 增殖细胞(S期、G1期、G2初期)


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