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荧光原位分子杂交染色体分析技术

一、简介(introduction)

染色体原位分子杂交技术(Chromsome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization)的发展为研究染色体上DNA的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定,灵敏度高等优点,多彩FISH可在同一核内显示两种或多种序列,还可对间期核染色体进行研究(下图);应用不同的探针可显示某一物种的全部基因,某一染色体染色片段及单拷贝序列;结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结构研究,精确检测杂交信号。

二、探针(probes)

1.基因组探针(genomic probe):

人类基因组内一些高频率的重复序列,在进化上很少具有保守性。若以基因组DNA作为探针,这些存在于探针和靶细胞顺序中的高度重复序列之间会首先退火结合,越过那些保守的和单一的序列,故杂交会呈现出种特异性。利用这类探针在人鼠杂交细胞中可特异显示人的遗传物质。

2.染色体特异性序列探针(probe recognizing chromosome specific sequences):

目前在人几乎所有染色体中已经克隆出一些重复序列,重复一百到五千次不等,各具染色体特异性。大多在某一染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带。从而可特异性地识别某一染色体。

3.染色体文库探针(chromosome labraries probe):

染色体文库收集人类单条染色体的DNA作为探针,又称整体染色体探针。单条染色体的获得一般有两种方法:来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株,或经流式细胞分类仪从染色体悬液中分离。

4.单一序列探针(single-copy sequences probe):

FISH有一弱点,就是要求探针足够大,探针越小,杂交位点检出率就越低。欲利用FISH检测存在基因组内的单一序列基因,最有效的方法是应用含大插入片段的克隆载体,如全Cosmids(载约40kb的插入片段),更大的YAC载体(载100-800kb插入片段)。若掌握好,小到2kb的质粒探针亦可用FISH方法定位,但效率较低。

组织切片间期染色体荧光原位杂交
组织切片间期染色体荧光原位杂交

三、FISH技术系列

1. 24色mFISH核型分析技术

24色mFISH是近年建立的一种新技术。其原理是使用5种荧光染料按比例标记探针,杂交后形成24条染色体各自呈现特异的荧光色彩以供核型分析(下图)。为研究人员提供了更丰富详尽的细胞遗传学信息,包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位,尤其为肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的方法 。

食管癌细胞系24色染色体m FISH核型分析
食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析

2.原位杂交显带技术(in situ hybridization banding,ISHB)

为了准确定位原位杂交部位所处染色体及其区带,染色体必须显带。但无论是先杂交后显带,还是先显带后杂交,杂交与显带过程会互相影响效果。后来人们注意到,人类短间隔插入重复序列中的一种Alu家族,Alu片段约300bp长,在基因组中重复约九十万次,平均间隔3-4kb就插入一个。有人利用部分Alu序列作为引物,用PCR方法扩增Alu之间的DNA,称Alu-PCR法。但Alu序列在基因组内分布不是随机的,有些区域比较密集,有些区域较稀疏。只有前者才有PCR产物。人们用Alu-PCR产物作为探针与人类染色体标本杂交,结果得到类似R带的荧光带型。故人们在进行基因定位时,只需将目的探针与Alu-PCR探针同时应用,用不同颜色的荧光标记,就可同时显示杂交信号和染色体带型。

3.FISH基因定位(FISH mapping)

基因定位时,不但需要确定某段靶序列在染色体上的位置,尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的排列次序和距离,才能绘出基因图。一般用同位素杂交:先确定每一靶序列在中期染色体上的位置,然后根据它们到端粒的距离确定出线形排列次序。而用FISH方法,两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交,只要根据两种颜色杂交位点的相互位置,就能直接确定次序。但中期染色体是线形DNA分子经过折叠和包装后形成的,若两个靶序列相距很近,例如间距小于1Mbp,受包装过程的影响,它们在线形DNA分子上的排列与在中期染色体上的排列不一定相同,甚至可能完全相反。学者们发现,靶序列之间在间期核的平均相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正相关。利用间期核FISH分析不但能排除染色体包装的影响,还能提高测距的分辨率(下图)。

食管癌细胞单条染色体涂,同时特异位点定位BAC FISH
食管癌细胞单条染色体涂,同时特异位点定位BAC FISH

4.FISH的应用

(1) 基因定位与基因制图(gene mapping) 原理前面已叙述。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。

(2) 基因诊断(gene diagnosis) 精确、直观、明了

(3) 间期细胞遗传学(interphase cytogenetics)

(4) FISH在肿瘤生物学中的应用

 ① 肿瘤细胞遗传学(onco-cytogenetics);

 ② 基因定位:FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位;

 ③ 病毒基因插入基因组部分的检测:虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主,也有像腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况,对深入研究病毒致癌机理,以及检测、防治肿瘤均具有重要意义;

 ④ 基因的扩增与缺失:原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有:突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有:点突变、基因缺失。FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法,能将基因扩增和染色体重复分开。


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