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病理组织学常用制备技术

一、组织的固定

(一)固定的概念

应用各种方法使病理标本尽量保持其离体前状态的过程称为固定(fixation)。

病 理标本(样本)离体后,由于微环境的变化将发生自溶和(或)腐败,使其结构破坏。固定的目的和机制是:①使蛋白质凝固,终止或减少分解酶的作用,防止自 溶,保存组织、细胞的离体前结构状态,包括保存组织或细胞的抗原性,使抗原不失活,不发生弥散。②保存组织、细胞内的蛋白质、脂肪、糖原、某些维生素及病 理性蓄积物,维持病变的特异性特征。③使上述物质转为不溶解状态,防止和尽量减少制片过程中人为的溶解和丢失。④起助染作用。

固定方法有:①物理学方法,如低温冷冻,干冰(dry ice,即固态无水碳酸)冰冻真空脱水,石蜡渗入法。②化学方法,采用各种化学溶液作固定液,使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。

固定应在标本离体后尽快进行,小标本可在取材后直接放入固定液内,大标本应在手术结束前或结束后迅速放入固定液内。
固定液与标本的比例不得少于标本体积得5倍。有特殊要求者应事先选定相应得固定液,如欲查糖原,应选择无水乙醇作固定液等。
固定得时间应适当,微小标本(如胃粘膜等)2~4h即可,大标本应置放12~24h,但亦不要过久,以免影响抗原性,造成免疫组化操作中得困难。

(二)常用固定液及其配制

固定液分单纯固定液和混合固定液。

1.甲醛(formaldehyde)

是无色气体,易溶于水成为甲醛溶液。易挥发,且有强烈刺激气味,常用得是37%~40%得甲醛溶液,商品名为福尔马林(formalin)。用作固定的浓度习惯为10%福尔马林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成),实际含甲醛4%。

10%福尔马林渗透力强,固定均匀,对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好,是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织,易产生黑色的沉淀,称福尔马林色素。

2.乙醇

无色液体,易溶于水,它除可作为固定剂外,还可作为脱水剂,对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度,乙醇渗透力校弱,它能溶解脂肪,核蛋白被沉淀后,仍能溶于水,因此核的着色不良。

3.中性甲醛液(混合固定液)

甲醛(浓)120ml,加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)4g,磷酸氢二纳(Na2HPO4)13g。此液固定效果比单纯10%福尔马林要好。

4.AF液(混合固定液)

95%乙醇90ml,甲醛(浓)10ml。也有配方是95%乙醇85ml,甲醛(浓)10ml,冰醋酸5ml。

此液除有固定作用外,兼有脱水作用,因此,固定后可直接入95%乙醇脱水。

以上4种固定液中,以中性甲醛为首选,其次为10%福尔马林,乙醇应尽量不用。

二、常规石蜡切片操作

(一)组织洗涤

经过固定的组织一般都要洗涤(washing),其目的是清除组织内外残留的固定剂,以免影响脱水等后续过程;防止有些固定剂在组织中发生沉淀或结晶而影响观察。洗涤时最好是从容器的底部入水,再从容器上面缓慢流出,这样2h即可,若为陈旧标本则需24h。

(二)组织脱水

1.概念

为保证石蜡有可能进入组织内部,采用适当方法,将已固定和水洗过的组织中的水分彻底驱除的过程称为脱水(dehydration)。脱水剂必须是与水在任何比例均能混合的液体。最常用的脱水剂为乙醇,其它尚有正丁醇和二氧已环以及丙酮等。

2.浓度与时间

脱水用的乙醇浓度一般从70%~75%开始,然后依次80%→95%→100%,即由低浓度逐步到高浓度。脱水的时间与组织大小、厚薄有很大关系、组织厚 大,脱水时间要长些;而小薄的组织脱水时间相对的可以短些。组织脱水时间在低浓度乙醇中可以长些(如70%~80%),而在高浓度乙醇中要短些,这是因为 高浓度的乙醇渗透力不强,延长脱水时间无益,相反高浓度乙易使组织收缩、变脆,致使以后切片和观察困难。

(三)组织透明

采用既能与脱水剂 (如乙醇)混合,并使之被提去(dealcoholisation),又能作为石蜡溶媒的诱导剂,使石蜡真正渗入组织中的过程称为媒介 (intermediary)。由于常用的透明剂(如二甲苯)作用之后,其折射指数与组织蛋白折射指数接近,组织显示出半透明状态,因此,通常又称此过程 为透明(clearing)。但并非所有媒介过程均使组织透明。

常用的透明剂为二甲苯,它易使组织收缩、变脆,故透明时间不宜长,一般1..5~2h,二节(即换2次,下同),最好是肉眼观察,见组织呈棕黄*色或暗红色透明状(象琥珀样)即可。

(四)组织浸蜡

组织经媒介(透明)处理后,置入熔化的石蜡内浸渍,使石蜡分子浸透入组织中的过程称浸蜡或石蜡渗透(infiltrating)。渗透的过程也可用火棉胶代替石蜡,称为浸胶。但其透明过程应作相应更动。

浸蜡一般分2~3节,总共4~24h,浸蜡时间过短,蜡没有完全渗入组织中,组织过软,切片困难;浸蜡时间过长,造成组织硬脆,切片也困难。

(五)组织包埋

把浸蜡的组织包在蜡里成块,使之有一定的硬度和韧度,便于在切片机上夹持切片,称之为包埋(embedding)。

1.注意事项

(1)包埋框要比组织块大,这样保证包成的蜡块组织四周都有蜡边。

(2)胃、肠、胆囊等组织,应将能看到组织学各个层面的一面作为切面。其它组织应将切面朝下。

(3)包埋蜡冬季用低熔点(56~58℃),夏秋季用高熔点蜡(60~62℃)。

(4)包埋蜡最好是经多次熔化、沉淀过的蜡,这样的蜡干净、致密,利于切片。

2.脱水机脱水、透明、浸蜡时间

3.手工组织脱水、透明、浸蜡时间

手工浸蜡只有一节,故在组织透明后将沾在组织上的二甲苯尽量多去掉(一般是将组织倒在铺有数层滤纸上,再一个个拣回,或将整个脱水篮用力甩几下),再浸蜡。

(六)组织切片

1.切片过程

把 切片刀架上,固定紧,然后将蜡块在切片机固定器上夹紧。先修块,左手转推进器,右手转轮盘,直到把组织全部切出,这时左手松掉推进器而持毛笔,右手旋围轮 盘,蜡片切成后,右手用小镊子摄蜡片,左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开,切面朝下把切片放入50℃水中,摊平后用镊子轻轻将连续蜡片分开,再用载玻片捞 起,蜡片应捞在玻片的1/3处,蜡片厚度一般在3~5μm。

2.注意事项

(七)HE染色

1.原理

HE染色也称苏木精-伊红染色,它是常规染色。

苏木精是一种天然染料,它本身并不能染色,在经氧化后变成苏木红才是真正的染料,苏木对细胞核的亲和力并不强,而在媒染剂的帮助下才能较好显示细胞核,此时细胞核呈红色,只有在碱性环境中,苏木才变成蓝色。

伊红Y是人工全盛染料,它可能是通过渗透或弥散作用完成染色的,因此和组织万分结合是不牢固的。它对细胞质着色。

2.染色程序

3.注意事项

4.染色液的配制

①Gill改良苏木精液

苏木精2g,无水乙醇250ml,硫酸铝17.6g,蒸馏水750ml,碘酸钠0.2g,冰醋酸20ml。先将苏木精溶于无水乙醇,硫酸铝溶于蒸馏水,再将 两液混合后加碘酸纳,最后加入冰醋酸。此配方为半氧化苏木精液,碘酸纳为氧化剂,硫酸铝为媒染剂,此液不会产生沉淀并很少有氧化膜。

②沉淀酸化伊红丫乙醇液

伊 红丫20g,蒸馏水500ml,浓盐酸10ml。将伊红与蒸馏水混合溶解后加入浓盐酸,搅拌,过夜。过滤、滤液不要,用蒸馏水多次冲洗滤纸中的沉淀,然后 将沉淀物连同滤纸一起入温箱中干燥,用95%乙醇1000ml配成饱和液。使用前取饱和液1份,95%乙醇2~3份,配成染色液。在用此液染色前最好将切 片先在95%乙醇中过一下,以保护染色液。

③盐酸乙醇分化液\70%乙醇99ml加浓盐酸1ml。

三、快速石蜡切片操作

(一)应用范围

(1)替代冷冻切片,在没有条件制作冷冻切片的单位,用作术中诊断;

(2)快速诊断:适用于门诊外地患者,1天可取报告。

(二)切片制作

(1) 将送检的各类组织按《规范》(一)编号登记、眼观、描述记录后,用大头针和羊皮纸包好,投入配制好的固定液烧杯内5~10min(固定液配制:95%乙醉85ml,甲醛10ml,冰醋酸5ml);若组织较厚,可在预固定后修薄,重复固定;

(2)无水乙醇、丙酮脱水3~5min;

(3)浸蜡5min;

(4)常规石蜡包埋,或封固于预制好的蜡块内;

(5)常规HE加温染色。

(三)注意事项

(1) 制作快速石蜡切片全过程过程均加温在65~72℃范围内操作,可用快速组织处理仪、或在恒温水浴锅或恒温箱内完成;

(2) 替代冷冻切片可随到即做,一般在30min内完成;若成批操作,则可根据标本的数量多少,酌情延长时间;

(3) 制作快速石蜡切片,操作人员必须经过一段时间的训练和摸索,在取得一定经验、技术较熟练能保证切片质量后,方可受理对外服务,以把好质量关。

四、冷冻切片操作

冷 冻切片的方法是一种最省时最快速的制片方法。因此主要用于临床手术中的病理诊断上。其原理很简单:冷冻使组织变硬,以代替石蜡做浸蜡。组织中的水分起着浸 蜡的作用,用OCT做包埋剂,将组织固定在冷冻头上,在短时间内冻好,可以立即在冷冻机上进行切片,不需要经过脱蜡,可随时染色,节省了时间。另外,在冷 冻切片的过程中,没有一个步骤使组织接触到任何有机溶剂或其他试剂能溶解或破坏组织中的脂肪、酶以及抗体。因此,冷冻切片也常用于:①显示组织中的脂质和 中性脂肪;②显示酶的活性;③神经组织的染色;④免疫荧光技术。

冷冻切片种类很多,以前有氯乙烷法、二氧化碳法、半导体冷冻法等。这些方法在使用 过程中都存在着一定的难度和不方便,制做出的切片质量也不好,直接影响到诊断。随着医学技术的发展,以上方法已淘汰,现在使用的冷冻切片机(恒冷切片 机),从根本上解决了不利于切片的难题。能更快、更方便地切出较好的切片,而且人为的缺陷也少。

冷冻切片目前最广泛应用于临床手术中的病理诊断,手术医生根据病理诊断结果决定手术范围,因此做出一些高质量的冷冻切片至关重要。

冷冻切片操作程序:

1.冷冻切片机要始终处于运行状态,即使在不做冷冻切片时也要开着致冷,不能时开时关,以免影响机器寿命。

2.手术取下的新鲜组织不要固定,因固定过的组织不利于切片,而且还会影响染色。

3. 用OCT做包埋剂,起到支撑的作用。先将OCT标在固定头上再将组织放在OCT上,OCT不要太多,以免流到固定头外,组织表面露在OCT外。

4. 外固定头放在冷冻机内的速冷台上,在-25℃左右,冻10min,视组织不同而时间略有差异,组织较大或脂肪组织时间可长一些,一般情况下10min左右即 可。如果冷冻不足,则切片可呈粥糜状或切不下来;如果冷冻过分,则切片呈碎悄状或切片上呈条痕状,都得不到良好的切片。

5.高速刀的角度,固定好,切片刀要快。

6. 把冻好的冻头夹到切片机上,用精调修平组织,使其暴露最大切面,将微调刻度调在5μm,放下抗卷板开始切片,得到满意切片后,打开抗卷板,将组织贴在载玻片上。载玻片要放平。动作要稳,一次完成,这样才能将切片完整的贴在载玻片上。

7.切片晾干后用95%乙醇固定10s,水洗后进行常规染色。

8.冷冻切片完成后取下冻头组织,固定后做常规切片。将冷冻机内的组织碎屑清扫干净,定期打开紫外线消毒。


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