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家兔急性肾小管坏死实验

【目的要求】

1.复制急性中毒性肾功能衰竭的动物模型

2.观察升汞中毒家兔的一般状态,尿液的变化,测定酚红及血清尿素氮、血清钾水平以了解肾功能情况,并观察肾脏的形态改变。

3.加深理解急性肾衰的病因、发病机制和机能代谢变化。

【实验原理】

采用重金属类肾毒物HgCl2,造成家兔急性肾小管坏死。

【实验动物】

家兔,体重 1.5~2.0 kg。

【药品与器材】

1% HgCl2溶液,生理盐水,0.6%酚红溶液,50%葡萄糖液,尿素氮标准应用液Ⅰ(1ml = 0.025mg氮),二乙酰-肟- 硫氨脲(DAM-TSC)液,酸混合液,5%醋酸溶液,尿素氮标准应用液Ⅱ(1ml = 0.005mg氮)。

兔手术台,i-STAT血气分析仪、721型分光光度计,ATC-1E型屈折度计(尿比重检测计),离心机,显微镜,水浴锅,电子称、手术器械一套,动脉插管1根,输尿管塑料插管,50ml、200ml、1000ml微量移液器,注射器,5ml刻度吸管,洗耳球,滴管,玻片,玻璃试管,试管夹,试管架,酒精灯。

【实验步骤】

1.家兔急性中毒性的制备

实验分为两组家兔,一组为正常对照组,一组为肾中毒实验组。于实验前一天,家兔称重后,按剂量1.2ml/Kg,皮下或肌肉注射一次氯化高汞(HgCl2),造成急性中毒性肾小管坏死病理模型。对照组家兔则在相同部位注射同量的生理盐水。

注意:

(1)此步骤由实验技术人员在实验课前一天完成操作,但同学须掌握造病方法。

(2)实验课时,学生各分组中,有一组用对照组动物进行实验,其结果应提供其它小组使用来进行对照分析;对照组的分组学生也可使其它任何一组的造病动物来源的实验资料,进行分析。

(3)实验动物耳部记录有该动物的体重,各组可用以作记录体重的依据。

2.颈动脉插管术与血样本的制备

(1)取正常或中毒家兔在记录体重后,固定于兔手术台;

(2)颈部去毛,手术部位局麻;

(3)在甲状软骨水平下作颈部正中切口,长约4cm,正对气管软骨环,逐层钝性分离,暴露喉结以下气管软骨环后,再向两侧分离,并在胸锁乳突肌内侧下方分离出侧颈总动脉,长度约2.5~3cm。

(4)动脉插管前,远心端必须先结扎,用动脉夹夹住近心端。

(5)然后用眼科剪刀剪开动脉壁的三分之一大小,注意遮掩,小心出现喷血。

(6)插入前端已剪成斜口的导管,结扎插入导管部的血管,使导管被固定。

(7)血气分析 打开颈总动脉的动脉夹,弃去最先流出的2、3滴血液后,然后立即将插管口直接对准电极板芯片的注血口,注入全血到标准刻度,盖上小盖,插入i-STAT血气分析仪,进行血气分析。

(8)再经动脉插管取正常或中毒家兔血2~3ml,待凝固15~20min后,离心3000rpm,5~10min,分离血清。用滴管将血清吸出,分别移入干燥的小试管中备用。

所制备的血清用来测定血清尿素氮和血清钾,方法见附录部分的介绍。

3.首次取尿液样品和输尿管插管术

(1)下腹部剪毛,局部麻*醉,在耻骨联合上1.5cm处作正中切口,长约4cm。分离皮下组织,沿腹白线切开腹膜,暴露出膀胱。用注射器吸出膀胱内全部尿液置于试管(10ml的尖底离心管)中备用。

此尿液样用来测定尿比重、尿蛋白定性和尿沉渣镜检,方法见附录部分的介绍。

(2)输尿管插管术:将膀胱向前下方翻向体外,在膀胱底部找到并分离一侧输尿管,在输尿管靠近膀胱处用线结扎,略等片刻,待输尿管略充盈后,用眼科剪剪一小口,向肾脏方向插入一根细塑料管,结扎固定插管,以备收集尿液。如果插管失败,可改为在实验末收集膀胱内尿液,作测定用。

4.酚红排泄试验

从兔耳缘静脉准确快速注入0.6%酚红溶液(1ml/只),并开始计时,然后从耳缘静脉缓慢输注50%葡萄糖液20ml,使引起利尿作用。此后收集60min尿液,进行PSP测定,方法见附录部分的介绍。

注意:如因总实验时间的限制,可以统一用收集30min的尿液,估计实验动物酚红排泄的情况。

5.肾脏的形态观察

实验结束后,用经耳缘静脉注射5~10ml空气的方法,将对照和实验性肾功能衰竭家兔处死,取出肾脏,称肾脏的重量,测定肾与体重的比值(肾体比,体重指去肠道后的体重)。

观察肾中毒家兔肾脏的体积大小,表面色泽;在矢状方向横剖切开肾为两半后,观察皮质条纹及色泽;在再度合拢两半肾后,观察切口能否完全对合。以病肾与正常肾脏作比较。

【附录】

1.血清尿素氮测定

(1)原理:血液和尿中的尿素在强酸条件下与二乙酰-肟(Diacetylmonoxim)和硫氨尿(Thio-Semicarbazixe)共煮,生成红色复合物。颜色深浅与尿素氮含量成正比关系。

(2)操作方法

按表所示,分别在空白管、标准管、测定管A和测定管B按顺序加入各种试剂,混匀,然后置沸水锅中准确计时煮沸10min,置流水中冷3min后比色,用520nm波长比色,以空白管调零。

血清尿素氮测定时各管试剂加样顺序表

试剂(ml)

空白管

标准管

测定管A

测定管B

0.5

0.1

0.5

0.5

DAM—TSC液

0.5

0.5

0.5

0.5

酸混合液

4.0

4.0

4.0

4.0

血清管

-

-

0.02

0.02

标准应用液II

-

0.4

-

-

注:测定管A为正常家兔的血清,测定管B为肾中毒的家兔血清

(3)血清尿素氮测定的计算方法

测定管光密度(Du)/标准管光密度(Ds)*0.002*(100/0.02)=Du/Ds*10=血清尿素氮(mg%)

2.尿比重测定

用吸管取尿液滴加于ATC-1E型屈折度计(尿比重检测计)的检测面上,盖上盖后,通过接目镜观察尿比重数值,记录尿比重读数。

3.尿蛋白定性检查

取正常或肾中毒家兔的尿液各约2~3ml,分别放入试管中,以试管夹夹住试管,在酒精灯上加热至沸腾(注意试管口不要对着人,小心加热,切勿让试管内尿液溢出)。若有混浊,加入5%醋酸3~5滴,再煮沸。若尿变清,说明原先出现的混浊是因尿内无机盐引起;加酸后若混浊加重,则表示尿中含有蛋白质,根据尿液混浊程度可估计尿蛋白量的多少。

“-”尿液清晰,不显混浊,无明显蛋白尿。

“+”尿液出现轻度、白色的混浊(含蛋白质0.01~0.05g%)。

“++”尿液呈稀薄乳样混浊(含蛋白质0.05~0.2g%)。

“+++”尿液乳浊,或有少量絮片存在(含蛋白质0.2~0.5g%)。

“++++”尿液出现絮状混浊(含蛋白质>0.5g%)。

4.尿液镜检

(1)将收集的尿液取出一滴置于玻片中,与显微镜下,细胞计数至少检查10个高倍视野;管型计数至少检查10个低倍视野,用最低至最高数报告。如WBC 2~6/HP;管型0~3/LP。

(2)亦可取一定量的尿液分别置于两支离心管中,离心沉淀600rpm? 5min,取尿沉渣涂片,先低倍后高倍镜观察,计数10个不同视野的管型和细胞的近似平均值,其中管型以低倍视野计数。

5.PSP试验

将60min(或30min)内收集的全部尿液(包括可能在膀胱中最后抽取的尿液),全量置于500ml量筒(或刻度烧杯)内,加入10%氢氧化钠5ml,并加水至500ml,搅拌均匀后从中取出10ml溶液置于试管中,与一系列不同酚红浓度的标准管比较,判定由尿排出的酚红的百份比。

按下表配制的酚红标准液,可计算出一小时内排出酚红的百分率(近似值)。

【试剂的配制方法】

1.血清尿素氮测定用试剂

(1)二乙酰-肟-硫氨尿液

称取二乙酰600mg,硫氨尿30mg,蒸馏水溶解并加至100ml。

(2)酸混合液

浓磷酸(85-87%)35ml,浓硫酸80ml,慢慢滴加于800ml水中,冷却后加水至1000ml。

(3)尿素氮标准液的制备

①储存液(1mg氮/ml)

称取分析纯尿素2.143g,加0.01N硫酸溶解,并加至1000ml,置冰箱内保存。

②尿素氮标准应用液(0.025mg氮/ml)

吸取尿素氮标准储存液2.5ml,加0.01N硫酸至100ml。

③尿素氮标准应用液(0.025mg氮/ml)

吸取尿素氮标准应用液20ml,加0.01N硫酸至100ml。

2.酚红标准液的配制(如下表)

各种浓度酚红标准液的配制

试管号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

100%酚红(ml)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

0.05%氢氧化钠(ml)

9.5

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

标准浓度值(%)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

【注意事项】

1.血清、标准液等试剂量应准确。

2.加入标准应用液Ⅱ之后,应不超过1~2min,立即放入沸水中进行后面的操作。

3.煮沸及冷却时间应准确,否则颜色反应消退。

4.正常家兔血清尿素氮14~20mg%,急性升汞中毒性肾病家兔血清尿素氮约为正常值的1~2倍。

【思考题】

1.根据实验结果,分析升汞引起急性肾功能衰竭的机制。

2.依据血气分析结果,讨论引起机能代谢发生了哪些变化?为什么?

3. 结合本实验结果,分析产生尿蛋白、管型的机理。

4. 引起急性肾功能衰竭发生的常见原因有哪些?如何分类?

5. 急性肾功能衰竭病人进入多尿期,尽管尿量已有明显增多,但可存在氮质血症,其原因是为什么?

【实验结果记录】

急性肾功能衰竭实验指标的测定记录表
实验项目 造病家兔 对照家兔

尿液检查

尿比重    
尿蛋白检查    
尿液镜检    
PSP实验 60min酚红排泄率    
60min尿量    
血清尿素氮测定    
肾脏形态    

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