弥散性血管内凝血的造病和实验室检测

【目的要求】

1．通过DIC动物模型的复制，进一步了解DIC的病因及发病机制。

2．联系理论观察急性DIC各期血液凝固性的变化，并讨论发生这些变化的原因及其病理意义。

3．了解DIC的诊断标准，熟悉常用的实验室检查指标及其意义。

【实验原理】

通过静脉注入兔脑粉浸液，启动外源性凝血系统而导致DIC。

【实验动物】

家兔，体重? 1.5～2.0 kg。

【药品与器材】

1%普鲁卡因，3.8%枸橼酸钠，血小板稀释液，兔脑匀浆，0.7%肝素。

兔手术台，电子称，显微镜，离心机，721型分光光度计，水浴箱、手术器械，微量加样器，动脉插管，血小板计数板，10 ml、5m1注射器各2支、肝素抗凝管3支、枸橼酸钠抗凝管3支。

【实验步骤】

1．称重、麻*醉和固定动物 家兔称重，固定于兔手术台，颈前部手术野剪毛备皮。抽取1%普鲁卡因2ml在手术切口部位作局部麻*醉，作颈前正中切口（切口位置应低于甲状软骨水平，切口长度约4～5cm）。分离家兔一侧颈总动脉（长度约3～3.5cm），用动脉夹夹闭颈总动脉近心端，远心端结扎，向心脏方向插管，结扎固定插管。

2．取预先准备的肝素抗凝管和枸橼酸钠抗凝管（含枸橼酸钠0.3ml）各3个，实验者应分别做好取血次序的标记。

3．用作正常对照的各项指标的血标本的制备

取测定血小板和其它出、凝血指标用的血标本时，放松动脉夹，最先流出的数滴血应弃去。

（1）先用一小块玻璃纸，接取兔血一大滴，并立即取其中10ml血液放入2.0ml血小板稀释液内充分混匀，作血小板计数（方法见附录）。

（2）然后分别在肝素抗凝管内放入兔血1.5ml，在枸橼酸钠抗凝管放入兔血3.5ml（取血完毕用生理盐水冲洗动脉插管以防管内血液凝固）。

取血管应迅速用小片玻璃纸封闭试管口，上、下颠倒试管使血液与抗凝剂混匀(注意勿震荡)，平衡后离心3000 rpm? 10min，小心取出上层血浆，另置干净小试管，并加上标记。肝素抗凝所制备的血浆用以测定纤维蛋白原，枸橼酸钠抗凝所制备的血浆用以测定PT和3P试验（方法见附录）。

4．DIC的造病

取37℃水浴预热和保温中的兔脑匀浆，剂量以8ml／Kg体重计算，经耳缘静脉以1ml/min的速度匀速推注。若注射过程中发现动物突然挣扎、呼吸急促，应立即停止推注并及时采血，方法同步骤3。

5．分别在全量兔脑匀浆注射完毕后的即刻、注射后30或45min时（视手术所用时间长短和实验课时多少决定）各采血样一次，方法同步骤3。

6．按照附录的方法，进行血小板计数，PT测定，3P试验和纤维蛋白原含量的测定。

7．实验完毕后，将动物处死。

【附录】

1．血小板计数（BPC）

用微量加样器吸取10μl兔全血，擦净吸头外的血液，迅速加入到预先准备的2ml血小板稀释液中，充分混匀后，用滴管将试管内已稀释血液滴到计数板上静置10min，等血小板完全下沉后，用高倍镜计数，注意：

（1）要准确数出计数板中央l大方格（即25个中格400小格）的血小板数，乘以2000就是每立方毫米的血小板数，或者在中央1大方格内，准确计数四个角上的中格和中央的1个中格，一共5个中格的血小板数，乘以1万就是每立方毫米的血小板数。

（2）在高倍镜下，血小板体积甚小，在大量红细胞中间是个小圆点，调整显微镜的微调时，可以见到小圆点（血小板）应有较强的折光性。

2．凝血酶原时间（Prothrombin Time简称PT）

（l）取被检血浆0.lml，置于小试管内，放入37℃水浴预温。

（2）在上述试管内加入P试液0.2ml，同时开动秒表并轻轻地侧动试管，至液体停止流动或出现颗粒为止，即为凝固终点，立即停止计时，记录PT测定值（秒）。

（3）重复3次测定，取平均值作为测定结果。

正常参考值：人12±1s，兔6～8秒，狗7.3～10s。

3．血浆鱼精蛋白副凝试验（3P试验）

（l）取被检血浆0.5ml，置于小试管内，放入37℃水浴3min预温。

（2）在上述试管内加入硫酸鱼精蛋白液50ml，混匀，在37℃水浴中放置15min。在观察结果时，将试管轻轻地摇动，有白色纤维或凝块为阳性；完全混浊无白色纤维为阴性。

4．纤维蛋白原定量

饱和氯化钠法

（l）取血浆0.5ml，置于12×100ml的试管中，加入饱和NaCl溶液4.5ml，充分混匀，置37℃水浴中，温育3min，取出后再次摇匀。

（2）对照管试液的配置处理：取生理盐水0.5ml加入饱和NaCl溶液4.5ml进行同样操作。

（3）选用波长520毫微米，以对照管试液调定光密度测定仪的零点，然后测定被测样品试液的光密度，按下式计算样品中纤维蛋白原的含量。

纤维蛋白原含量的计算公式： 测定光密度/0.5*1000=mg%

【注意事项】

1．采集抗凝血需掌握好血液与抗凝剂的比例。

2．注射兔脑匀浆前，要做好第二次采血的一切准备工作，准备好抗凝管、玻片、秒表。这因为注射兔脑匀浆过程中，动物极易猝死，如到临时再作准备，则往往因准备不及，动物已死亡，采不到血。

3．静脉推注兔脑匀浆的速度快慢是实验成败的关键，故在控制好速度的前提下，应密切注意动物的反应。

【思考题】

1．静脉注入兔脑浸液后为何能复制出家兔DIC模型？试述其发生机制。

2．根据实验中的血液学实验结果，讨论急性DIC产生的原因、机制及各项结果间的关系。

【实验结果记录】