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弥散性血管内凝血的造病和实验室检测

【目的要求】

1.通过DIC动物模型的复制,进一步了解DIC的病因及发病机制。

2.联系理论观察急性DIC各期血液凝固性的变化,并讨论发生这些变化的原因及其病理意义。

3.了解DIC的诊断标准,熟悉常用的实验室检查指标及其意义。

【实验原理】

通过静脉注入兔脑粉浸液,启动外源性凝血系统而导致DIC。

【实验动物】

家兔,体重? 1.5~2.0 kg。

【药品与器材】

1%普鲁卡因,3.8%枸橼酸钠,血小板稀释液,兔脑匀浆,0.7%肝素。

兔手术台,电子称,显微镜,离心机,721型分光光度计,水浴箱、手术器械,微量加样器,动脉插管,血小板计数板,10 ml、5m1注射器各2支、肝素抗凝管3支、枸橼酸钠抗凝管3支。

【实验步骤】

1.称重、麻*醉和固定动物 家兔称重,固定于兔手术台,颈前部手术野剪毛备皮。抽取1%普鲁卡因2ml在手术切口部位作局部麻*醉,作颈前正中切口(切口位置应低于甲状软骨水平,切口长度约4~5cm)。分离家兔一侧颈总动脉(长度约3~3.5cm),用动脉夹夹闭颈总动脉近心端,远心端结扎,向心脏方向插管,结扎固定插管。

2.取预先准备的肝素抗凝管和枸橼酸钠抗凝管(含枸橼酸钠0.3ml)各3个,实验者应分别做好取血次序的标记。

3.用作正常对照的各项指标的血标本的制备

取测定血小板和其它出、凝血指标用的血标本时,放松动脉夹,最先流出的数滴血应弃去。

(1)先用一小块玻璃纸,接取兔血一大滴,并立即取其中10ml血液放入2.0ml血小板稀释液内充分混匀,作血小板计数(方法见附录)。

(2)然后分别在肝素抗凝管内放入兔血1.5ml,在枸橼酸钠抗凝管放入兔血3.5ml(取血完毕用生理盐水冲洗动脉插管以防管内血液凝固)。

取血管应迅速用小片玻璃纸封闭试管口,上、下颠倒试管使血液与抗凝剂混匀(注意勿震荡),平衡后离心3000 rpm? 10min,小心取出上层血浆,另置干净小试管,并加上标记。肝素抗凝所制备的血浆用以测定纤维蛋白原,枸橼酸钠抗凝所制备的血浆用以测定PT和3P试验(方法见附录)。

4.DIC的造病

取37℃水浴预热和保温中的兔脑匀浆,剂量以8ml/Kg体重计算,经耳缘静脉以1ml/min的速度匀速推注。若注射过程中发现动物突然挣扎、呼吸急促,应立即停止推注并及时采血,方法同步骤3。

5.分别在全量兔脑匀浆注射完毕后的即刻、注射后30或45min时(视手术所用时间长短和实验课时多少决定)各采血样一次,方法同步骤3。

6.按照附录的方法,进行血小板计数,PT测定,3P试验和纤维蛋白原含量的测定。

7.实验完毕后,将动物处死。

【附录】

1.血小板计数(BPC)

用微量加样器吸取10μl兔全血,擦净吸头外的血液,迅速加入到预先准备的2ml血小板稀释液中,充分混匀后,用滴管将试管内已稀释血液滴到计数板上静置10min,等血小板完全下沉后,用高倍镜计数,注意:

(1)要准确数出计数板中央l大方格(即25个中格400小格)的血小板数,乘以2000就是每立方毫米的血小板数,或者在中央1大方格内,准确计数四个角上的中格和中央的1个中格,一共5个中格的血小板数,乘以1万就是每立方毫米的血小板数。

(2)在高倍镜下,血小板体积甚小,在大量红细胞中间是个小圆点,调整显微镜的微调时,可以见到小圆点(血小板)应有较强的折光性。

2.凝血酶原时间(Prothrombin Time简称PT)

(l)取被检血浆0.lml,置于小试管内,放入37℃水浴预温。

(2)在上述试管内加入P试液0.2ml,同时开动秒表并轻轻地侧动试管,至液体停止流动或出现颗粒为止,即为凝固终点,立即停止计时,记录PT测定值(秒)。

(3)重复3次测定,取平均值作为测定结果。

正常参考值:人12±1s,兔6~8秒,狗7.3~10s。

3.血浆鱼精蛋白副凝试验(3P试验)

(l)取被检血浆0.5ml,置于小试管内,放入37℃水浴3min预温。

(2)在上述试管内加入硫酸鱼精蛋白液50ml,混匀,在37℃水浴中放置15min。在观察结果时,将试管轻轻地摇动,有白色纤维或凝块为阳性;完全混浊无白色纤维为阴性。

4.纤维蛋白原定量

饱和氯化钠法

(l)取血浆0.5ml,置于12×100ml的试管中,加入饱和NaCl溶液4.5ml,充分混匀,置37℃水浴中,温育3min,取出后再次摇匀。

(2)对照管试液的配置处理:取生理盐水0.5ml加入饱和NaCl溶液4.5ml进行同样操作。

(3)选用波长520毫微米,以对照管试液调定光密度测定仪的零点,然后测定被测样品试液的光密度,按下式计算样品中纤维蛋白原的含量。

纤维蛋白原含量的计算公式: 测定光密度/0.5*1000=mg%

【注意事项】

1.采集抗凝血需掌握好血液与抗凝剂的比例。

2.注射兔脑匀浆前,要做好第二次采血的一切准备工作,准备好抗凝管、玻片、秒表。这因为注射兔脑匀浆过程中,动物极易猝死,如到临时再作准备,则往往因准备不及,动物已死亡,采不到血。

3.静脉推注兔脑匀浆的速度快慢是实验成败的关键,故在控制好速度的前提下,应密切注意动物的反应。

【思考题】

1.静脉注入兔脑浸液后为何能复制出家兔DIC模型?试述其发生机制。

2.根据实验中的血液学实验结果,讨论急性DIC产生的原因、机制及各项结果间的关系。

【实验结果记录】

注入兔脑匀浆前后动物呼吸与状态观察
  注兔脑匀浆前 注兔脑匀浆后
腹式呼吸    
一般状态    

DIC实验指标的测定记录
项目 注射前 注射后(立即) 注射后(30/60分钟)
BPC      
PT(sec)      
3P试验      
Fbg定量      

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