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免疫组织化学在乳腺癌的作用(Breast carcicnoma)

乳腺Ca是女性中最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万妇女发生乳腺Ca,并有50万左右的患者死于这种病。由于这种病严重地危及了妇女的健康,世界上许多有关的机构都开展了对该病的研究,直至现在,根据对该病的治疗和有关文献资料显示,该病在治疗和预后方面已经取得了重大的进展。

当患者被诊断为乳腺癌后,根据目前临床上治疗的需要,提出了重点必须检测的主要免疫组织化学的指标即:Her-2、ER、PR、EGFR、IGBR、P53、CD117、BCL-2、PCNA等。

(1)乳腺的正常结构

乳腺的来源起于胚胎外胚层的原始表皮,位于胸前两侧皮下浅筋 膜的浅层与深层之间。肉眼大体为乳头,乳晕和乳腺。从临床的角度常将乳腺分为五个不同的区域,即乳晕区外上象限区,内上象区,外下象限区和内上象限区。其中外上象限区的乳腺组织最为丰富,但也是肿瘤的好发区。一发现该部位有硬块或者异样,就必须及早做检查。

从组织学的角度,乳腺被结缔组织分隔为15-25叶,每叶又分为若干小叶,每个小叶有肌上皮细胞。由单层柱状上皮,复层柱状上皮和复层扁平上皮构成的导管有腺泡,末梢导管,小叶内导管,小叶间导管和总导管。所有这些是乳腺的主要组成成分,除些之外,还有辅助的成分即脂肪、结缔组织、血管、神经、淋巴管等。

(2)乳腺的常规石蜡切片
乳腺组织,含有大量的脂肪,胶原纤维,在每一块组织中,都含有各种各样的成分,要作好一张HE的切片,也较为困难,因此,对于较特殊的组织,必须特殊处理国。比如大量的脂肪,取材后,可先将其放入乙醚或酒精乙醚混合液中浸泡2-4小时,作除脂处理,然后才与其它组织块作常规处理。另外,由于它胶原纤维较多,脱水较为困难,取材切忌过太大或太厚。

(3)常见乳腺Ca的种类

1.乳腺原位癌,系指癌细胞的生长未突破基底膜。根据其来源和结构,又可将它们分为:①小叶癌,即指癌细胞由小叶上皮细胞发展而来。在一般的情况下,小叶由大小较为一致的圆形细胞所填充,形成大小不等,形态各异的不等小叶,小叶包膜完整,癌细胞不向外浸润生长,核染色深。应用免疫组化标记时,可用 EMA,CK,(广谱),基本都为阳性或至强阳性。

2.浸润性导管癌

镜下的组织学形态为多种多样,可以呈弥漫性片状生长,也可呈界限清楚的因巢条索状或呈单个细胞浸润性生长。

肿瘤组织的大小差异大,形状各异,核分裂象较多见,细胞核和核仁明显突出。

应用免疫组化可进行鉴别,用CK(广谱)或用低分子量如,8.18或19型,标记阳性,应用EMA标记,也可显示阳性。

(4)乳腺Ca常见的检测指标

当患者被确诊为乳腺癌并且实行完成手术后,利用其切除的组织再进行检测,以利于进一步的治疗。目前,对肿瘤的治疗有:①综合治疗,根据肿瘤患者机体状况,肿瘤的病理类型,侵犯范围和发展趋向,合理地有计划应用现有手段以期最大限度地提高治愈率,生存期和生活质量。②手术治疗指对癌症原发灶,引流淋巴组织及其可能受侵蚀的周围组织全部或部分切除的治疗方法。③化学治疗—指应用一种或数种化学药物,通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。④放射治疗是指利用高能电磁辐射(放射线)主要是X线和R线治疗肿瘤的一种方法。⑤生物治疗 通过从体外补充,诱导或活化体内固有的生物反应调节系统,包括具有细胞毒性的细胞和因子,以调整这种生物反应,或通过基因传导,置换增补等基因治疗的思路,或设计对CD分子,基因靶拉或抗原靶位的抗癌抗体疗法和生物导向治疗的方法。⑥内分泌治疗,由于激素能选择性地作用于相应的肿瘤组织,对一般增殖 速的正常组织不会产生抑制作用,因而不会引起骨髓抑制,亦无骨肠粘膜及毛书细胞增殖受到抑制所导致的种种副作用。对于乳腺癌患者来说,在确定其治疗方案前,首先要检测几种指标如:Er,Pr,EGFR,IGFR,CD117,P53,Her-2,Bcl—2,PCNA,等。

1.表皮生长因子受体-2 ( Epidermal growth factor receptor-2,Her-2)被简称为Her-2,neu或者C-erbB-2.

它还有3个家族成员即Her-1,Her-3和Her-4。根据研究认为,Her-2和其家族中的三个成员,有着相互间密切的关系和高度的同源性,是一种跨膜糖蛋白。Her-2属于一种原癌基因,位于17号染色体17q21。从其家族成员中,从Her-2的功能和所起的作用,它是最主要的一种,它有三个功能域 :一个细胞外受体结合点,一个亲脂性的跨膜部分与一个具有酪氨酸激酶活性的细胞区域。当配体细胞表面的异二聚体受体复合物包括Her-2蛋白结合后,导致细胞内酪氨酸激酶的蛋白活化,发生酪氨酸自身的磷酸化。[14]许多研究表明:Her-2受体基因在细胞因子信号传导通路中以及在控制正常细胞生长与分裂中都扮演着重要的角色。
对于Her-2的研究,已经进行了许多,它在许多肿瘤细胞中, 都可见到过度表达的阳性物。如乳腺癌,结肠癌,肝癌,胃癌等。从目前的情况认为,判断乳腺癌预后的指标,除了原发肿瘤的大小,肿瘤的分期,淋巴结的转移数目,雌激素和孕激素受体的阳性与否外,Her-2也是判断预后的一项指标。

Her-2检测结果阳性与否也直接关系到患者治疗方案的确定。许多研究表明,乳腺癌Her-2阳性的过度表达即阳性强度达到三级的乳腺癌患者,其预后较差,恶性度高,转移明显,生存率降低。

①应用什么方法来检查Her-2.

目前,国际上检测 Her-2的方法有,免疫组化法,Fish法(Fluorescrnce in situ hybridization荧光原位杂交),Western blot ,Elisat和PCR法等。在这诸多方法中,最常用,最可靠,最简单,最便利和最经济的方法是免疫组化法,因为它是大多数病理科必备的一门技术,作为病理诊断的辅助手段之一,它是不可或缺的一门技术。目前大多数的病理科,免疫组化技术稳定,质量可靠,技术成熟定性。

②如何对Her-2进行判断。

Her-2是一种跨膜的酪氨酸受体,它的阳性表达在细胞膜上,评判它的阳性以及阳性的强度目前都以四级为基准即阴性(一);阳性(+);中度阳性(二);和强阳性(三)。

有的是以癌细胞占阳性细胞的比例来分级即所有癌细胞都阴性(一);占癌细胞总数的1-10%为轻度阳性(+);占癌细胞总数的11-50%为中度阳性(二);占癌细胞总数为51%以上者为强阳性(三)。

我们认为,应该根据癌细胞表达的情况来评判为最好。癌细胞没表达的为阴性(+);隐约可见到少数癌细胞的膜不完整的阳性为轻度阳性(+);部分至大部分的癌细胞阳性,但其膜还不够完整为中度阳性(二);全部的癌细胞阳性且阳性膜完整为强阳性(三)。

③评判时应注意的问题:

A.切片现象。细胞排列不齐,不在一个水平线上,因而在切片的时候,有的被拦腰切断,将细胞切成两半,这种可以有完整的细胞膜;有的由于细胞排列歪斜,切片时有的只切其一角,有的则切到其盲端或者顶部,这种现象镜下见到 状或断续状。

B.抗原的分泌颗粒。有些抗原,它可被分泌后排泄至细胞浆中,镜下见到有颗粒状反应。

C.抗原的扩散融合,乳腺癌组织被切除离体后,由于标本较大,没有得到及时的固定,导致某些抗原发生游散和融合的现象。

④Her-2的实验结果

在50例乳腺癌患者检查Her-2中,阳性27例,占总数54%;其中轻度阳性(+)9例;占18%;中度阳性(二)7例,占14%;强度阳性(三)11例占22%;我们的结果与有人报道的阳性(过度表达)25-30%基本一致。由此认为,免疫组化技术检测 Her-2是完全可依赖的。

2.雌激素,孕激素,雌激素受体和孕激素受体(Estrogen and Estrogen receptor,Er)

雌激素属于类固醇激素,它的基本结构的特点是在分子中有17位氢的功能存在,如在17位碳原子上羟基置换氢原子称为雌二醇,而在16及17位碳原子上氢被羟基置换则为雌 三醇。

雌激素的主要功能是:

①对性器官(如子宫、阴道、外阴器官等)具有特殊的功能,它可刺激其生长,发育。

②对输卵管的作用主要是促进输卵管肌层的增长,增加其血运,使内膜增生并出现纤毛细胞。

③对阴道的作用主要是促进上皮细胞的成熟,增生和角化,使粘膜变厚并增加细胞内糖原含量。

④对乳腺及副性特征的影响主要是促进乳腺腺管的生长发育。

激素这所以能在靶细胞内发挥作用是通过其受体来实现的。[16]受体具有两项基本功能:其一是识别出特殊的化学信号---配体。其二是用某种方式将配体---受体配合物中的信息信号继续放大,改变靶细胞的生化速率,发生适当的细胞效应。

乳腺是女性激素的靶器官,激素对乳腺的作用是需要通过乳腺上皮内的雌激素受体和孕激素才能实现。正常乳腺上皮细胞可存在Er和Pr,当细胞发生癌变时,Er和Pr可以部分或全部保留,也可以部分或全部丧失。或者可以是Er保留Pr丧失,或者是Er丧失,Pr保留,如果癌细胞仍保留受体,说明该乳腺癌的生长和增殖仍受内分泌的调控,称激素依赖性乳腺癌;如果癌细胞丢失了受体,则该乳腺癌的生长和增殖不再受内分泌的调控。称非激素依赖性乳腺癌。 我们的一组例实验 的结果为:Er 和Pr全阳性者31例,为59.6%,Er和Pr全为阴性者:15例,占28.8%,Er阳性Pr阴性者2例占5.7%,Er阴性和Pr阳性者2例,占5.7%。

①Er和Pr的检测是对乳腺癌患者确定治疗方案和确定预后的需要。

乳腺癌诊断一经确立,对其治疗前,都 必须进行Er和Pr 的检测,以利于治疗方案的确立,检测的结果一般有如下 几种情况:

A.Er和Pr均为阳性。在癌细胞中,可见到两种受体均为阳性,说明这肿瘤含有的激素受体和功能都与正常细胞一样,都受到激素的调节,因此用内分泌方法治疗有效率较高,达到70-80%。

B.Er和Pr均为阴性。在所有的癌细胞中,均未见到两种受体的反应情况,说明该肿瘤已完全脱离激素的调控。因此,用内分泌方法治疗其效果就不理想,其有效率不足10%。

C.Er阳性,Pr阴性,在少数病例中两项检测可见一项阳性,如Er阳性,Pr阴性,占实验中的5.7%,说明部分肿瘤已 部分脱离激素调控。

D.Er阴性,Pr阳性,这种情况与上述的基本一样,也占少数,约占5.7%。

②对Er,Pr阳性的判定

判定Er,Pr的阳性与否,应从主要细胞的着色情况来判定,在乳腺癌的癌细胞核中可见棕黄*色的阳性物,则可判为阳性。有人认为,具有生物学效应的细胞核内受体才是真正的受体。又可称Ⅰ型受体;而胞浆内的所谓受体,实际上是一种能与性激素结合的大分子蛋白,其功能只是将性激素从胞浆转送到核内的载体作用,实非真正受体,故也可称Ⅱ型受体。

Er和Pr的判断,不光是判断阳性与否就可以了,还要判断它的强度。目前是以四级为广泛使用的方法,即阴性(一),阳性(+),中度阳性(二)和强阳性(三)。一般10%以内的癌细胞阳性为(+),11-50%的癌细胞阳性为中度(二),51%以上的癌细胞阳性为(三)

③Er和Pr的检测方法

Er和Pr的检测方法有很多种,尤其是许多公司都 生产出了专门检测Er和Pr的试剂盒,但从我们的自身的技术条件方面认为,应用一般的抗体,就能检测到满意的结果。不过在检测Er时,必须注意如下问题:

A.抗原修复时,要注意温度。据文献介绍用于检测Er和Pr的抗原修复,最好是用高压修复法,其次才是水浴修复法,但据我们的实验应用微波修复法,都能获得满意的结果。

B.抗原修复时,要注意时间的长短,高压抗原修复时,时间在2-4分钟,微波抗原修复,时间在18分钟。以上。

3.P53

P53是一种抑癌基因,经研究认为,该基因与人类的许多种恶性肿瘤如乳腺癌,结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌等有关。P53肿瘤抑制基因的散发性突发,是所发现的人类恶性肿瘤唯一最常见的基因异常。[17]它有两种类型:野生型和突变型。野生型半襄期较短,约为20分钟左右,在细胞内的含量较低,由于这种原因,目前应用免疫组化方法来检测无法检测到。它跟DNA有很高的亲合力,可以抑制DNA的合成和复制,从而抑制细胞增殖。突变型半襄期较长,约4-8小时,在细胞内的含量也较高。应用免疫组化方法检测可以被 检测到。肿瘤分化程度的高低与P53蛋白的阳性率之间有显著差异。阳性的强弱与分化程度也密切相关,分化越低,阳性强度超高。这种由于其构象发生改变,对DNA亲合性下降,抑制细胞增殖能力减弱,因此能与一些癌蛋白形成稳定的复合物,使半襄期延长,含量比正常增加。

在一组实验中,乳腺癌P53阳性9例52.9%,阴性8例47%,结肠癌20例,阳性15例,75%,阴性5例25%。子宫内膜癌15例,全为阳性,肺癌17例,阳性76.4%,阴性4例23.5%,在其他肿瘤中,11例,阳性4例36.3%,阴性7例,63.6%。

经研究发现P53抑癌基因位于17号染色体短臂,编码为53kd的核结合蛋白,在正常的情况下,它通过参与细胞周期的负调节而起到调控细胞的分化作用,同时在细胞的凋亡,它可诱导凋亡来触发细胞死亡,阻止具有癌变倾向的基因突变细胞的产生,它也参与 对DNA受损的重要修复过程,由于DNA受损,P53基因产物大量累积,可诱导细胞进入G1期,启动修复系统进行修复,若修复过程失败,它可诱导凋亡来触发细胞死亡,阻止具有癌变倾向的基因突变的细胞产生。

4.上皮生长因子受体(Epidermdl grouth factor receptor,EGFR)

EGFR经实验证明,它位于第7号染色长臂,和C-erdB-2一样,同属Ⅰ型生长因子受体家旅。是一种酪氨酸激酶受体,主要分布于细胞膜,在有些病例,由于切片的原因,有的可以在细胞浆或细胞核上。在正常的情况下,EGF是一种潜在的有丝分裂因子,当其与靶细胞受体结合时,就能够刺激细胞增殖,这种主要在上皮的快速增殖部位,许多研究表明,EGFR在许多肿瘤细胞中的表达往往比正常组织细胞中的表达要高,这是因为EGFR的基因在肿瘤细胞中复制加快,转录增加的结果。这些现象说明EGF、EGFR在某些旅恶性肿瘤的发生及生长中起一定的作用,如胃癌,大肠癌等。

王仰坤等对99例慢性胆囊炎壁肥厚和13例慢性胆囊炎后壁 肥厚型腺癌的EGFR研究结果是:慢性胆炎囊壁肥厚轻度和中度显示区域性弱阳性表达, 性胆囊炎壁肥厚重度呈现区域性阳性表达。慢性胆囊炎壁肥厚重度。慢性胆囊炎后壁肥厚型腺癌与慢性胆囊炎壁肥厚轻度中度之间的阳性表达差异有显著性P<0.02。

他们的研究还发现在癌旁组织或在不典型增生细胞和肿瘤细胞的过度区有异常表达,可能是肿瘤周围的细胞受到肿瘤细胞分泌因子刺激开始表达EGFR,而EGFR的表达使“正常”的周围细胞逐渐向恶性表型转化。

陈乔尔等对65例口腔鳞癌EGFR表达的研究中,EGFR+21例。EGFR(二)19例,阳性率为61.5%,研究表明EGFR的超量表达与癌基因的扩增和突变有关。


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