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免疫组化阳性病例的评判及相关问题

对于免疫组织化学后切片的评判,要做到准确、客观,必须具备以下几个条件:

1.主要细胞阳性。即靠其作出诊断的病变细胞,在一张切片中,有各种各样的细胞,有正常的和病变的,有的切片是以病变的细胞为主,有的则是正常的或炎症组织细胞为主。如鼻咽部粘膜组织的活检,其表面有一层粘膜上皮,CK和EMA标记时,它可显示出很强的阳性,但这种不能作为诊断的依据,必须认真地观察上皮粘膜下的组织,这个地方才可见到有病变的组织或细胞。如在这地方出现细胞的异常,即细胞大小不一,核染色深或者排列紊乱,加上CK和EMA阳性,即可作出阳性的诊断,有条件的还必须作一张嗜银纤维的染色,这对于诊断很有帮助,如癌细胞周边可有大量嗜银纤维围绕,癌组织或细胞中没有嗜银纤维的存在。

1.2 阳性细胞的阳性物定位要准确,不能模棱两可,是是而非。

阳性细胞所出现的阳性物,无非是在细胞核、细胞膜和细胞浆,但不管在什么部位都要定位准确。例如Er和Pr,它们的阳性物是在细胞核,如果在细胞浆中见到棕黄*色的反应物,也应判为阴性。因为具有生物学效应的细胞核内受体才是真正的受体,又可称为工型受体;而细胞浆内的所谓受体,实际上是一种能与性激素结合的大分子蛋白,其功能只是将性激素从胞浆转送到核内的载体作用,实非真正受体,故也可称为Ⅱ型受体[9]。至今为止,于核内阳性的抗体有:Er, Pr,P53, Bcl-6,BRCA1,HBcAg,HCV,ki-67, P16,P21,P63,PCNA,ToPoⅡ,在判断核内阳性时,除了核内有真正的阳性外,其余都应判为阴性。

1.3每批检测的切片,都须设有准确的阳性、阴性或空白对照片,以确保检测病例的准确性和可靠性。

阳性对照片是用已被免疫组化确定为阳性的病例或者选用某些组织一定含有的抗原(如标记CK时,上皮组织表达一定阳性)作为阳性对照片,于每天的免疫组化染色中与待检片一起进行染色,最后的结果阳性片一定阳性,以其为标准,来评判每一例切片。在每一批免疫组化的检测中,并非所有的切片都是阳性,也并非所有的切片都为阴生,有了正确的阳性对照片,对于无表达的阴性片,就能够确切地、干脆地作出阴性的判决。阳性对照片的设立,可以排除假阴性。

在设立阳性对照片时,应以每天新鲜切片的病例为最好。以往,有人为了贪图方便,一次性切了大量的切片贮备着,作为每次使用的阳性对照片,经实验证明:这种方法不可取,因为切片切好后长期存放,会使切片上的抗原受到破坏,随着时间的延长,切片上的抗原会逐步消失,最后阳性片也呈阴性。另者,切好后的切片如存放于4℃冰箱中,对脱蜡也极为不利,切片不是不易脱蜡就是脱蜡不干净,影响标记或造成背景的染色,效果不好。

1.4可以利用自身设立阳性对照片。

为了节省抗体,节省人力和物力,可以正确地使用自身对照的方法。在一批待测片中,如有确定的欲测抗原,就不需专门设立一张阳性对照片,而可利用欲测切片上的必定阳性组织来进行。如检测B细胞或T细胞时,有淋巴结的切片,这种情况就可以不设阳性对照片,阳性对照片的设立,一是排除待检片中的假阳性,假阴性病例;二是检测操作中有没有存在技术方面的问题,如果操作不当,就不可能得到阳性结果或出现假阴性。现在各单位,每天检测的项目都特殊多,如果每项都设立一张对照片,是不可能的,因此,要准确地选择对照片。

2.如何解释免疫组织化学染色后切片中许多不该着色的成分都着色的问题?如标记淋巴组织细胞时,有的上皮细胞也着着,标记CK时,肌层组织也着色,这究竟是什么原因呢?

2.1 在各种组织中,都存在着各种酶,一般认为,酶蛋白和辅助因子单独存在时,它们都没有活性,因而也就没有催化底物这一功能。但是,当它们结合在一起时,就具备了酶的特有性状,催化底物的作用。在检测的各种组织中,往往就存在上述的情况。当加入标记的抗体后,这些抗体中都含有与同种类属相应的酶蛋白或辅助分子,当它们与撒落于各种组织中的酶蛋白或辅助分子结合后,就可以产生效应,催化底物,并产生不溶性的棕黄*色。检测的切片含有各种成份,如上皮、肌组织和神经、间质等待。当测其中的某一项目时,其它成份由于受到影响,便会产生各种不同的反应。如检测CK时,由于含有上皮成份的组织在固定前没及时处理好,造成这些组织的变化,将部分的抗原撒落扩散到周边组织,周边组织可将这些抗原吸收,吞噬或吸附,因而在最后显色时就可以被显示出来。

3.膜性表达的抗体,为什么会出现膜性的加宽、加厚,并出现浆中表达的现象,这可能与下面的情况有关:

3.1 抗原的融合,导致膜性抗原的膜加大加厚,组织由于固定不及时,抗原向两边扩散,加宽了膜性的表达,就如同我们写字时有润纸的现象,当下笔时,写下的墨水向两边浸润一样。

3.2 切片的原因导致误认为细胞浆中的表达。

对于细胞密集的组织,由于其排列不在一平面上,当切片时,有的细胞被拦腰切断,这种有完整的细胞膜,有的被部分切断,细胞膜则仅有片块状,有的则切到盲端,而这盲端遮盖了另一细胞的断面,如同另一细胞的浆内物质,这种现象可将其称为“切片现象”。

4. 评判界定免疫组化染色阴性必须具备的条件。

4.1 阳性对照片表达阳性,待测片诊断细胞呈现阴性。

4.2 自身对照阳性,诊断细胞阴性。

4.3 经特殊手段如抗体修复时间延长,或者双重抗原修复,诊断细胞仍呈阴性。


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