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抗原修复

一、为什么要进行抗原修复?

组织在制作过程中,由于化学试剂的作用封闭了抗原,又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲,致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来,为了解决上述的问题,利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。

在免疫组化染色后的镜下观察中,有发现这样的结果,阳性物反应不强,时隐时现,表达不均匀,有时可出现假阴性,这是因为:

1.组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的,因为它能和多种不同的功能基团结合,在多数情况下在其间形成桥键8。这也是甲醛的一个作用,因为它是一种聚合固定剂,因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用。

2.甲醛在保存进程中会形成羟甲基,也可封闭抗原决定族。据French和Edsall的研究认为,最常遇到的甲醇反应,就是加到一个含反应性氢原子的化合物中,形成一个羟甲基化合物。

3.在组织固定过程中,甲醛与蛋白质发生交联,形成醛交联蛋白,这种化合物封闭了抗原,使之无法表达出来。

为了解决上述存在的问题,更好地暴露出抗原,将其很好地显示出来,目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复。

二、用什么方法进行抗原修复?

至今为止,抗原修复有许多种方法,在这些方法中,有的是根据抗体的要求来进行,有的是根据抗原的表达程度来进行,我们则对每种病例每项检测,都要求必须进行抗原修复,以达到抗原全面表达的最佳状态。

(一)物理化学试剂抗原修复法。

1.真空负压抗原修复法:

2.微波辐射抗原修复法:

3.高压抗原修复法:

4.隔水热抗原修复法:

5.电炉加热抗原修复法:

对各种抗原修复方法的评价。

1.真空负压抗原修复法:

这是一种操作简单,效果特佳,温度恒定,能一次性处理大量切片的方法。该法的最大的特点有四:一是各物质的分子在失重的情况下四处飘游,增加各分子间的碰撞机会;二是有恒定的温度,既能使甲醛固定的蛋白发生变性,又不需要使抗原修复液达到沸腾,不会导致切片因抗原修复液的沸腾而离开载片,保证了染色的成功率,减少了因掉片而反复制片的麻烦,保证了病理报告的及时发生,为病人争取更多的时间;三是不受条件限制,不管是金属性的不是非金属的都可以进行操作;四是可以一次性制作大批的切片。

2.微波辐射抗原修复法:

该法与上法相比,从实验结果看,都不分上下。它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然,光靠微波的作用是不够的,还必须依靠热的作用,方能达到目的。应用微波辐射,它有双重作用,微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热,当达到有效的温度后,就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是:产热迅速,容易操作,也容易引起抗原修复液的沸腾,使用微波炉时禁止使用金属性的器皿,以防引起失火或爆炸。

3.高压抗原修复法:

该法高压和高热来促进醛键的断裂,当加热至开锅,加上高压阀后,汽体喷出,此时的温度已达121℃左右。该法被应用于一些较难修复的抗原,经多次实验认为,该法效果不错。

4.隔水热抗原修复法:

该法应用隔水热方法,效果不及前面三种方法,它需要较长时间的热的作用,在早期应用于Er和Pr染色的抗原修复时,我们的修复时间为40分钟,如果达不到这时间,效果将不理想。

5.电炉加热抗原修复法:

该法是在没有上述的设备时才选用的一种方法,当然效果是最差的,因为它只是单靠热的作用,这是远远不够的,另外,电炉加热必须常用温度计来测量温度,对其温度不好控制,有时需要多次关闭电源来维持所需的温度。

抗原修复,必须注意以下问题:

1.PH值的应用范围及选择。

应用于抗原修复的物质很多,但至今为止,大家公认的最好的抗原修复液还是柠檬酸盐缓冲液PH6.0,据多年来的实践认为,该液确实很好,它适合于大多数的抗原,在常规应用的临床标记抗体中基本都适用,经用该液修复后的抗原表达增强,抗原的定性和定位很理想,结果不错。但近来也有文献报道,应用抗原修复液PH8.0的效果也不错。

2.抗原修复时应选择最佳温度。

据Masson等研究表明:70℃-90℃的温度对没有经固定的蛋白可发生变性,但经福尔马林固定的蛋白,要使其发生变性,温度必须在92℃↑。据实验认为温度在92℃-98℃是合适的,尤其在95℃为最好,这是因为:①这种温度未达沸腾,切片不容易脱离裁片;②能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等,处理时可以随意选择和确定抗原修复的作用时间。

3.抗原修复时有效温度所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同,抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间也不一样。

例如:真空负压抗原修复法,当达到预定的温度和所需的负压(66.7KPa)后可持续5-10分钟,微波辐射抗原修复法温度不好控制,抗原修复液容易沸腾,如果切片附贴任凭其沸腾持续5-10分钟。如果切片附贴很牢固,为了防止脱片,一发现抗原液已沸腾,即可关掉电源,待温度下降后,又可重开电源。如此反复数次,使之持续10分钟。不过似这种停停开开着的做法效果不如开着的,因为开着的除了热效应以外,还有足量的微波辐射。应用高压抗原修复法,当发现抗原修复液沸腾后,加上压力阀,出现喷气后,可持续时间达2-4分钟。隔水热加热抗原修复法,要特别注意内外液体的温度,内液指抗原修复液,外指浸泡抗原修复液容器的水,应用时用温度计浸入抗原修复液测试,使之保持在有效的温度(92℃↑)范围内。持续时间在40分钟,电炉加热抗原修复法,其持续时间在10分钟以上。由于效果较差,该法目前较少使用。

4.抗原修复液必须遵循自然降温规律,否则效果不好或达不到抗原修复的目的。

抗原修复持续时间过后,取出放于室温中让其慢慢地降温,决不能为了争取时间,强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结,要有一个自然环境让其自然放松下来,随着温度的降低,它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温,松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来,恢复不了原有的构型,达不到预想的效果。

5.尽量使用足量的抗原修复液。

抗原修复的方法,都采用加热的方法,尤其是微波辐射加热法,该法由于产热快。液体容易挥发直至干涸。因此,应用于抗原修复的液体,一定要充足,防止切片干涸。用于抗原修复的切片,如果由于液体少而导致切片的干涸,则应丢弃切片,因为热干涸的切片中的抗原是没办法补救的,因它是一种不可逆的现象。据实验认为,用于微波辐射抗原修复的液体,量大可多至1000ml。应用大量的抗原修复液时,由于它的量较大,可延缓了液体的沸腾时间,增加了切片受微波辐射的量,对抗原修复将达到彻底。

6.切片必须附贴牢固。

用于抗原修复的切片,必须附贴牢固,否则发生掉片,则前功尽弃。

(二)化学试剂抗原修复法:

1.胃蛋白酶消化法:

2.胰蛋白酶消化法:

评价:上面介绍了胃蛋白酶和胰蛋白酶两种酶的使用方法,因这两种酶在平常较常被使用,故而专门进行介绍,除此之外,无有几种酶如链霉蛋白酶,无花果蛋白酶菠萝蛋白酶等也可被用来消化切片。其用法基本一样。

现今应用酶来消化切片,主要是根据抗体的要求来进行的,否则都应用物理化学试剂抗原修复法来进行。因为酶消化不适合于多数的抗体,效果也没有其它方法好,因此临床上都较好用它。


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