常用免疫组织化学染色方法

( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)

• 1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。
  2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。
  3.无水酒精Ⅰ 30秒。
  4.无水酒精Ⅱ 30秒。
  5.95%酒精Ⅰ 30秒。
  6.95%酒精Ⅱ 30秒。
  7.90%酒精 30秒。
  8.80%酒精 30秒。
  9.70%酒精 30秒。
  10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)
  11.0.3%H₂O₂甲醇处理切片10-20分钟。
  12.水洗。
  13.抗原修复。
  14.PBS洗3次，1分钟/次。
  15.加入血清孵育20分钟。
  16.摔干血清，加入一抗60分钟。
  17.PBS洗3次，2分钟/次。
  18加入二抗孵育30分钟。
  19.PBS洗3次，2分钟/次。
  20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
  21.PBS洗3次，2分钟/次。
  22.DAB-H₂O₂孵育切片5-10分钟。
  23.PBS洗，水洗。
  24.Harris苏木素染核5-10分钟。
  25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)

• 1.切片脱蜡至水。
  2.0.3%H₂O₂甲醇处理切片10-20分钟。
  3.水洗。
  4.抗原修复。
  5.PBS洗3次，1分钟/次。
  6.加入血清孵育10分钟。
  7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
  8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。
  9.PBS洗3次，每次2分钟。
  10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
  11.PBS洗3次，每次2分钟。
  12.DAB-H₂O₂孵育5-10分钟。
  13.PBS洗，水洗。
  14.Harris苏木素染核5-10分钟。
  15.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法

• 1.切片脱蜡至水。
  2.0.3%H₂O₂甲醇真空负压处理5min.
  3.水洗。
  4.如果需要，可进行抗原修复。
  5.PBS洗3次，每次1分钟。
  6.加入正常血清真空负压处理5min。
  7.摔干血清，加入第一抗体，真空负压处理5分钟。
  8.PBS洗3次，每次2分钟。
  9.加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。
  10.PBS洗3次，每次2分钟。
  11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5分钟。
  12.PBS洗3次，每次2分钟。
  13.DAB-H₂O₂孵育5-10分钟。
  14.PBS洗，水洗。
  15.染核，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

注：真空负压即将真空干燥中抽成真空。负压达66.7KPa(500mmHg)

(四)Envision TM Systems.

• 1.切片脱蜡至水。
  2.0.3%H₂O₂甲醇处理切片10分钟。
  3.水洗。
  4.抗原修复。
  5.PBS洗3次，每次1分钟。
  6.加入一抗体孵育30-60分钟。
  7.PBS洗3次，每次2分钟。
  8.加入增强剂孵育20-30分钟。
  9.PBS洗3次，每次2分钟。
  10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育20-30分钟。
  11.PBS洗3次，每次2分钟。
  12.DAB-H₂O₂孵育5-10分钟。
  13.PBS洗，水洗。
  14.Harris苏木素染核5-10分钟。
  15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(五)免疫组化双染色法(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)

• 1.切片脱蜡至水。
  2.0.3%H₂O₂甲醇处理切片10分钟。
  3.水洗。
  4.抗原修复。
  5.PBS洗3次，每次1分钟。
  6.加入非免疫性动物血清，孵育10分钟。
  7.PBS洗3次，每次2分钟。
  8.加入第一抗体孵育60分钟。
  9.PBS洗3次，每次2分钟。
  10.加入生物素化的第二抗体，孵育10分钟。
  11.PBS洗3次，每次2分钟。
  12.加入链卵蛋白素过氧化物酶孵育10分钟。
  13.PBS洗3次，每次2分钟。
  14.加入DAB-H₂O₂孵育5-10分钟。
  15.PBS洗3次，每次2分钟。
  16.加入双染增强液，孵育10分钟。
  17.加入非免疫性动物血清孵育10分钟。
  18.PBS洗3次，每次2分钟。
  19.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
  20.PBS洗3次，每次2分钟。
  21.加入生物素标记的第二抗体孵育10分钟。
  22.PBS洗3次，每次2 分钟。
  23.加入链卵蛋白素碱性磷酸酶孵育10分钟。
  24.PBS洗3次，每次2分钟。
  25.加入AEC溶液，孵育5-10分钟。
  26.自来水洗。
  27.苏木素染核5-10分钟。
  28.水性封片。

注：1.第一种复合物也可先用链卵蛋白素碱性磷酸酶。

2.第1次显色也可用BCIP/NBT溶液，颜色为蓝黑色，但应与苏木素鉴别。

(六)、免疫组化的双染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)

• 1.切片脱蜡至水。
  2.0.3%H₂O₂甲醇处理切片10分钟。
  3.水洗。
  4.抗原修复。
  5.PBS洗3次，每次1分钟。
  6.加入选用的第一抗体孵育30-60分钟。
  7.PBS洗3次，每次2分钟。
  8.加入增强剂孵育20-30分钟。
  9.PBS洗3次，每次2分钟。
  10.加入酶标抗兔/鼠，复合物，孵育
  11.PBS洗3次，每次2分钟。
  12.加入DAB-H₂O₂孵育5-10分钟
  13.PBS洗3次，每次2分钟。
  14.加入选用的第二种抗体孵育60分钟。
  15.PBS洗3次，每次2分钟。
  16.加入增强剂孵育20-30分钟。
  17.PBS洗3次，每次2分钟。
  18.加入酶标抗兔/鼠碱性磷酸酶复合物孵育20-30分钟。
  19.PBS洗3次，每次2分钟。
  20.加入AEC溶液孵育5-10分钟。
  21.自来水洗。
  22.苏木素染核5-10分钟。
  23.水性封片。

(七)细胞培养片免疫荧光染色法。

• 1.将细胞于载片或盖玻片的片子用生理盐水洗几次。
  2.纯丙酮固定10分钟。
  3.PBS浸洗3次，每次1分钟。
  4.加入选用的第一抗体孵育120分钟。
  5.PBS洗3次，每次2分钟。
  6.加入荧光抗体孵育60分钟以上。
  7.PBS法3次，每次2分钟。
  8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。
  9.水洗，蒸馏水洗。
  10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。

(八)真空负压免疫荧光染色法染细胞培养片。

• 1.将细胞爬于载玻片或盖玻片的片子用生理盐水浸洗数次，彻底洗去蛋白液。
  2.纯丙酮固定5-10分钟。
  3.PBS浸洗3次，每次1分钟。
  4.加入选用的第一抗体孵育真空负压处理15分钟。
  5.PBS洗3次，每次2分钟。
  6.加入荧光抗体孵育真空负压处理15分钟。
  7.PBS洗3次，每次2分钟。
  8.0.1%伊文氏蓝衬染3分钟。
  9.水洗，蒸馏水洗。
  10.水性胶封片或用缓冲甘油封片。