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免疫组织化学技术的发展概况

一、免疫荧光细胞化学技术

1941年,浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术,它的原理是根据抗原抗体反应的规律,把已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗原或抗体,然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下,根据其形成复合物所发的荧光,来确定判断检测物的来源、性质和部位。目前,免疫荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域,如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等。

由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的准确性,又由于许多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞分类器等,该项技术可发展至更高的阶段,开创更新的领域。虽然如此,应用于临床作为病理学的诊断还是少之又少,相信随着各种技术的提高,在不久的将来,将会有更多的荧光抗体被应用于临床的诊断。

(1)常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有:

①异硫氰酸荧光黄(Fluoresein isothiocyanate,FITC):结晶粉末状,呈黄*色、橙黄*色或褐黄*色,易溶于水和酒精等溶剂,室温下可保存两年以上,最大发射光谱为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。

②四甲基异硫氰酸罗达明(Tetramethylyodamine isothiocyanate,TRITC):结晶粉末状,呈紫红色,易溶于水和酒精等溶剂。最大发射光谱为620nm,呈现橙红色荧光。

③四乙基罗达明(Tetramethylyodamine B200,RB200):结晶粉末状,呈褐红色,易溶于酒精和丙酮,但不溶于水。最大发射光谱为596~600nm,呈现橙红色荧光。

(2)常用的荧光标记法

①直接法:这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体,染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育,使之直接与载玻片上的抗原结合,于荧光显微镜下观察检查,作出判断。

评价:该法简单易行、特异性高、快速方便,常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其存在不足就是只能检测相应的一种物质,敏感性较差,效果有时不理想,目前较少作为更多方面的检测。

②间接法:该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后,继用间接荧光抗体,与前面的抗原抗体复合物结合,形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下,根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。

评价:本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多,发出的荧光亮度强,因而其敏感性强。目前本法应用较广泛,只需制备一种种属荧光抗体,即可适用于多种第一抗体的标记显示。

存在问题

1.制作好的切片不能长期保存,影响各种资料的积累。

2.所作出的结论较主观。

3.有些经固定的石蜡切片不适合等。

二、免疫酶细胞化学技术

这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,在检测时,抗原抗体复合物中带有标记结合上去的酶,其特性可催化底物,在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物,从而可用一般光镜来检测判断,确定组织的来源、种属和部位。

优点:

1、可用光镜检查。

2、切片可长期保存,有利于资料积累。

3、可以会诊,所得结果较为客观。

4、既适用于冰冻切片,也适用于石蜡切片。

5、技术较为简单,易于普及和推广。

存在问题:

1、酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学。

2、酶标记抗体分子量较大,对组织的穿透性较缓慢。

3、抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合,常可引起背景的染色,影响阳性物的判断。

4、敏感性不强,目前已不被使用。

三、非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在许多问题,1974年Strernberger等人建立了非标记抗体酶法,其中最具代表的方法是过氧化物酶法即PAP法。
奶头法的染色原理:应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体结合后的复合物与PAP复合物连接起来,形成较大的复合物,利用复合物中HRP水解底物而呈色。

PAP由3个过氧化物酶分子和2个抗过氧化物酶分子组成,呈五角形结构,较为稳定。

评价:PAP法自建立起至二十世纪九十年代初期被应用,它在当时来说具有较高的敏感性,有人认为它比酶桥法灵敏度高出20倍左右,有人则认为它的灵敏度与放射免疫法相似。

存在问题:

1、第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物。如第一抗为小鼠的,则第三抗体就一定要用小鼠的。

2、抗体孵育时间过长。第一抗体的孵育时要求放于4℃冰箱中过夜,时间可达十几小时。长时间的孵育可产生几种不良后果:一是容易产生背景染色;二是影响染色的成功率,常可导致切片脱离载玻片等。

3、复合物分子较大,移动缓慢,对组织的渗透力不强。

4、可产生背景染色,影响阳性结果。

5、整个过程需时过长,约20小时。

6、阳性物不明显不突出。

四、亲和组织化学法

由于其它方法存在许多问题,1981年Hsu等创立了美国广播公司法(抗生素蛋白-维生素H-peroxidase复杂的技术),它的原理是利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶,由酶催化底物,生成终产物,于抗原抗体活性部位沉淀下来。卵白素是一种糖蛋白,在鸡蛋白中被发现,分子量为68000,它与生物素有4个连接部位。据认为卵白素和生物素的亲和力要比抗原和抗体的亲和力高出百万倍,因而它们能够牢固地结合,又不影响它们间的生物活性。

美国广播公司法自1981年创立至今已有二十多年的时间,在各种技术高速发展的今天,这种技术能被较长时间的使用,说明它有着极强的生命力和实用性,这是因为它有着以下主要特点:

1.敏感性强,卵白素与生物有4个连接部位,据认为它比PAP法敏感性更高,高出约20-40倍。

2.需时少,节省大量的时间。如PAP法的一抗孵育时间于4℃冰箱中需十几小时以上,而本法一抗孵育时间在1-60分钟以内。

3.背景清晰,阳性物鲜艳易辨。

4.抗体可被高度稀释,增加标记病例,降低成本。

存在的问题:

1.需要预先形成复合物,即卵白素和生物素,在加于切片前的30分钟,先将两者混合起来,形成复合物。该复合物为三维结构,在结合了其它物质后,就会使自身体积增大,行动缓慢,活动受限。

2.卵白素中含有约7%的糖类,它可与组织中含糖基的物质起反应,造成背景的染色。

3.卵白素的等电点约10左右,可带较多的负电荷 ,纤维组织可带较多的正电荷,这两种电荷可互相吸引,造成背景的染色。

4.卵白素中有4个结合点,其中一半与连接抗体结合,另一半与复合物结合,如此可降低其敏感性。

五、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法(APAAP,Alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase)

1984年Cordellt Massen氏等人创立了APAAP法,该法的基本原理是在加入一抗后,依靠二抗的桥作用,将抗原抗体复合物和APAAP复合物连接起来,然后通过复合物中的磷酸酶对底物的水解,生成鲜红色或蓝色的产物。(鲜红色一般底物采用的是偶氮染料快红(fast red )或者蓝色快蓝色(fast blue)。

评价:在其它许多方法中,如ABC法和PAP法等,应用的显色剂都是3.3二氨基联苯胺(3,3,diaminobenzidine, DAB),据认为,该试剂有致癌作用,(现已认为它已没有致癌性作用),为了避免使用上述试剂,因而创立了这种方法。它敏感性高,不受组织中内源性过氧化物酶的影响和干扰,可产生出鲜艳的红色或蓝色阳性物,非常容易被鉴别,常被用作双标。

存在问题:

1.切片不能长期保存。因为显色用的是快红或快蓝,这些染料后着染色后的颜色,不能经过酒精的脱水处理,一浸入酒精,所着染的颜色将被全部脱掉。只能用水性胶封片,然该种封片法保存的切片时间不长,一般只有数月即会褪色。

2.切片的透明度较差,不到于拍摄极佳的照片。

六、免疫金银法(Immunoglold-sliver staining, IGSS)

1978年Geoghegan等首次应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的IGSS。

基本原理:通过免疫反应,沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化作用,用对苯二酚将银离子还原或银原子,被还原的银原子沉积在金颗粒周围形成“银克”。它本身具有催化作用,使更多的银离子还原并促进“银壳”越长越大,最终在光镜下就能看到被放大的黑褐色物质。

评价:

该法敏感性高,特异性强,据认为它比PAP法高20倍左右,背景较低,阳性物易辨性好,可用于任何切片,能检测微量的抗原。
存在问题:

1.操作繁锁,步骤较多。

2.需要预先制备成胶体金。

3.需要在暗室中进行。

4.由于使用的金-银试剂,容易造成沉淀或污染。

七、LSAB法,(Labeled streptavidin biotin) 或者SP法(Streptavidin)

ABC法虽然是一种很好的方法,但是在实际的应用过程中,确实也存在着许多问题,为了解决和克服存在的问题,90年代初提出了用链卵蛋白素(streptavidin)替代ABC法中的卵白素生物素复合物。该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白,有四个和生物素亲和力极高的结合点。

评价:LSAB法是目前国内使用最广泛的一种方法,由于它的敏感性强,效果好,背景清晰,无杂质而大受人们的欢迎。

其优点有:

1.不需预先形成复合物,分子体积小,行动灵活,对组织参透性强。

2.链卵蛋白素的等电点为5.5-6.7,接近中性,所带的负电荷少,不容易与组织中的正电荷发生相互吸引,因而可降低背景的染色。

3.链卵蛋白素不含糖基,不存在与组织中含糖基类的物质起反应的现象。

4.链卵蛋白素有4个与生物素结合的点,它们可以全部地和2抗上的生物素结合,从而增加其敏感性,从某种意义上讲,它比ABC法的敏感性起码增加一倍以上。

5.节省时间,每种抗体的孵育时间都在10-30分钟左右。

6.抗体可以高度稀释,增加标记病例,降低成本。

7.背景清晰,无非特异性染色,阳性物突出,明显易辨。

8.染色时间短,提高了染色的成功率,经几千例的实验证明,染色成功率几近100%,减少了反复制作的机会,保证了病理报告的及时发出,为病人的治疗和诊断赢得了时间。

八、nVision TM Systems

该法是近几年在国内推广使用的一种方法,它的原理是将多个抗鼠和抗兔诉IgG分子与辣要过氧物酶聚合,当形成复合物后,可直接与抗原抗体的复合物聚合在一起,经DAB显色即可完成染色。

评价:

1.该法敏感性更高,效果更好。

2.步骤减少,省时省力。

3.抗体的孵育时间可节省。

4.该系统不含有生物素,可以免除由内源性生物素所造成的背景染色。

5.背景清晰干净,阳性物突出明显。

九、真空负压LSAB法

该法创立于1992年,几经实验证明,该法效果好,质量高,能节省很多时间,并获得军队科技进步3等奖。其基本原理是:
各种物质的分子在真空负压的条件下,由于失重而飘游起来,从而增加了各物质分子间的碰撞机会,加速了抗原抗体的结合,使反应提前完成。

特点:

1.省时,全过程由过去的十几小时缩短为1-1.5小时,为患者获得更多的时间。

2.抗体可高度稀释,可达厂家推荐的稀释度高1-2倍,增加标记的病例,降低成本。

3.不需要用酶消化,简化了步骤;保证了染色的成功率,减少了返工的现象,节省了人力物力。

4.全部过程不需加温,减少摸索温度的麻烦,条件易控制。

5.不受其它条件的限制,每次可大量染片,多至百余张。

6.阳性反应物颜色鲜艳,色彩迷人,背景清晰,无非特异性染色,结果易判断。


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