酶组织化学(磷酸酶显示)

至今为止，已发现的酶有8000多种，至少有2500种有可能被应用。但应用组织化学显示的酶不多，仅有几十种至百余种。

酶是一切生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞各个部位都有酶存在。由于酶在生物体内无处不在，因而要将其充分地显示出来，必须首先要了解酶的特性，方能做到制备和保护好酶的活性。

一、酶的作用特点

①高度催化效率。酶作为一种生物催化剂，比其它非酶催化反应快，如脲酶在PH7.0 20℃时，催化尿素水解比非催化反应快1014倍。

②高度专一性（或特异性）酶对其所催化的底物具有较严格的选择性，一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键，以促进一定的化学变化，生成一定的产物。

二、影响酶活性的几种因素

①温度对酶的影响

酶反应需要一定的温度，但温度不是越高越好，是要有条件的，人体内多数酶的最适反应温度是在37℃左右，因而实验损伤中的温度都定在40℃以内，当温度升高至70℃以上时，就可以导致酶的变性、失活。另外，低温并不破坏酶的活性，根据这一点，许多研究用的材料，平常都保存在-70℃以上的温度，以保证日后的研究用。保存于低温的组化，恢复至室温后，便可用于检测酶的活性。

②机体供血对酶的影响

机体供血一经切断（如手术标本）就会造成对酶的影响，如细胞中的溶酶体酶，由于缺氧，细胞中包绕溶酶体酶的膜就会受到破坏而发生破裂，酶便可发生扩散。

③PH值的高低对酶的活性有影响。

在正常的情况下，各种酶都在各自的适宜的PH值中生活，如显示碱性磷酸酶时，孵育液中的最适PH值在9.5左右，而显示酸性磷酸酶时，其最适PH值则在5.0左右，虽然如此，但大部分的酶都有一个最适的PH7.0左右，高于或低于此范围将会影响酶的最高活性。

④底物深度对酶反应速度的影响

在酶组织化学中，当底物的浓度还没达到最高值时，其反应的速度与底物的浓度成正比，底物浓度愈高，其反应速度愈快，但当底物浓度达到所需的最高值时，其反应速度将趋于恒定。

⑤抑制剂对酶活性的影响

在酶反应过程中，加入某些试剂，造成对酶活性的下降或者终止酶的反应的称为抑制剂。抑制剂分为两大类：一类是不可逆性抑制剂，其主要形式是酶与抑制剂以共价键方式紧密结合，用透析法不易除去抑制剂，酶活性难于恢复。
另一类为可逆性抑制剂。当抑制剂与酶以非共价键结合后，用透析法可将抑制剂除去，使酶重新获得活性。

⑥激活剂对酶活性的影响

在酶反应的过程中，加入某些无机离子，使其活性增高，这类物质被称为激活剂。如检测碱性磷酸酶时，加入镁离子。这类物质有Mg²⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Fe²⁺等。

三、酶的分类：

根据国际酶学会议1961年的分类，将所有的酶分为六大类。

• ①：氧化还原酶，特性是转移电子，催化底物的氧化还原，如琥珀酸脱氢酶，乳酸脱氢酶等。
  ②：水解酶，特点是催化水解反应，增加或除去水，如酸性磷酸，酸和碱性磷酸酶等。
  ③：转移酶，特点是催化不同物质分子间某种功能基因的交换或转移，如γ-谷氨酰转肽酶等。
  ④：裂合酶，特点是催化一种化合物使之分裂为两种化合物，或者使两种化合物化合成一种的酶，如亮氨酸氨基酶和碳酸酐酶等。
  ⑤：异构酶，特点是催化同分异构体相互转化，如6-磷酸葡萄糖异构酶等。
  ⑥：合成酶，特点是催化两个分子化合物相互结合。如三磷酸腺苷酸等。

四、酶组织化学检测时必须注意的问题：

• ①组织的准备和切片的制作，必须注意不要影响酶的分布和活性。
  ②底物和辅助试剂必须以同等的速度进入所有的细胞及其所有的部分。
  ③如有可能仅用一种酶便可分解底物。
  ④辅助试剂必须做到既不要影响酶的反应，也不要影响底物的进入。
  ⑤酶反应产物必须快速地被辅助试剂俘获，这种必须依靠细胞内环境发生。
  ⑥最终产物必须快速沉淀，例如它在水溶液或在脂类物中必须是实际上的不溶性，而且它必须是无晶形的（至少是微晶形的）稳定的。
  ⑦参与反应中的底物必须不被限制，并且不被吸附到酶反应部位的其它结构上。
  显示酶的活性及形态学上的鲜艳度，应注意如下问题：
  ①组织和切片的制备，不要影响酶的分布和活性。

五、酸性磷酸酶的显示

1．改良的Gomori’s硝酸铅法

Ⅰ. 操作方法：

• ①恒冷箱冷冻切片，附贴于硅化载玻片上，电吹风吹干30分钟后，用纯丙酮固定5-10分钟。
  ②蒸馏水轻洗。
  ③将切片于孵育液中孵育30-120分钟（于37℃孵育箱中进行）。
  ④蒸馏水冲洗1分钟。
  ⑤1%冰醋酸水溶液浸洗30秒钟。
  ⑥蒸馏水冲洗1分钟。
  ⑦1%硫化铵水溶液处理1分钟。
  ⑧流水冲洗后再入蒸馏水洗。
  ⑨核固红染核5分钟。
  ⑩流水洗5-10分钟。

(11)常规脱水、透明并封固。

结果：细胞核红色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色。

2．改良的Gomorc氏硝酸铅法

• （1）石蜡切片脱蜡至水。
  （2）蒸馏水洗。
  （3）入孵育液中孵育（视各种情况而定）120分钟以上（在37℃孵育箱中）。
  （4）蒸馏水洗1分钟。
  （5）1%冰醋酸水溶液浸洗30秒钟。
  （6）蒸馏水浸洗1分钟。
  （7）1%硫化铵水溶液处理切片1分钟。
  （8）流水冲洗。
  （9）1%核固红染细胞核5-10分钟。
  （10）流水冲洗5-10分钟。
  （11）常规脱水、透明并封固。

结果：细胞核红色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色。

Ⅱ. 孵育液的配制：

巴比妥醋酸缓冲液（PH5.0）　　20ml

3%β-甘油磷酸钠　　　　　　　2ml

硝酸铅　　　　　　　　　　　24毫克

用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸铅，然后再加入3%β-甘油磷酸钠，彻底混合后过滤，再测定其PH值，如不足或高于，都应调校至5.0。

Ⅲ.注意事项：

① 依据当今之条件，制备切片，都以恒冷箱冷冻切片为好。因该法制作酶的破坏较少，反应及显示时间可以大大节省。

② 如果采用的是丙酮固定的切片，由于制作切片破坏了许多酶的活性，因而孵育切片时时间需延长，但这往往也容易引起背景的染色，应特别注意。

③ 孵育液可以连续几次使用，但应注意液体的挥发，如挥发过于严重，可适当添加适量的蒸馏水。

3.萘酚AS-TR或AS-BI磷酸酯法

Ⅰ.溶液的配制：（Nachthol AS-TR or AS-BI phosphate）

a液：萘酚AS-TR（或AS-BI）磷酸酯　　20mg

二甲基甲酰胺（Dimethyl formamide）　2ml

b液：醋酸钠（Sodium acefate） 1.17g

巴比妥钠（Sodium barbitone） 2.94g

蒸馏水　　凑足　　　　　　　　100ml

c液：硝酸钠（Sodium nitrite）400mg

蒸馏水　　10ml

d液：盐酸付品红贮存液

盐酸付品红（Pararosanilin hydrochloride）1g

蒸馏水　　20ml

浓盐酸 5ml

E液：孵育液的配制

a液　　　0.5ml

b液　　　2.5ml

c液　　　0.4ml

d液　　　0.4ml

蒸馏水　 6ml

注意：c液和d液相混合在一起并放置2分钟后再加入到其它液体中，这是染色能够成功的关键步骤之所在。

Ⅱ.操作步骤：

• ①切片如为石蜡切片，则应脱蜡至水，如为冰冻切片则用蒸馏水洗。
  ②入上述孵育液中孵育30-60分钟（37℃）如为石蜡切片则应根据不同的切片而定。
  ③蒸馏水洗。
  ④用2%氯仿提纯过的甲基绿作对比染色。
  ⑤水洗。
  ⑥用甘油明胶封固切片或者快速用酒精脱水，二甲苯透明并封固。

结果：酸必磷酸酶活性部位呈红色，核及背景呈绿色。

六、碱性磷酸酶的显示

1.Gomori氏钙钴法

反应原理：这是一种金属沉淀技术，酶水解底物β-甘油磷酸钠，使之产生磷酸离子，这种初级反应产物与钙离子发生反应，形成磷酸钙。进一步的用硝酸钴处理产生磷酸钴沉淀，这种产物此时用光镜是看不见的，必须进一步的处理，用稀释的硫化铵处理，使之形成一种可见的硫化钴的黑色沉淀物。

Ⅰ.孵育液的配制：

• 2%β-甘油磷酸钠　　　　　　　　　　　　　　　 2.5ml
  2%巴比妥钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.5ml
  2%硝酸钙（Calcium nitrate）　　　　　　　　　 5.0ml
  1%氯化镁(Magnesium chloride)　　　　　　　　　0.25ml
  蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.25ml

该液最后的PH应在9.0-9.4之间，如果没达到，应调校之。

Ⅱ.2%甲基绿的提纯

甲基绿属于二苯甲烷染料，在其结构上比甲基紫多一个甲基，当溶解时，溶液中由于甲基的存在，在大部分绿色的情况下，有少量的紫红色，使颜色不纯。为了获得纯绿色的染液，在配制溶液时，必须将杂色除去，氯仿的提纯将是为达染液纯绿的目的。具体做法是，取一分液漏斗，倒入配好的溶液100ml,再加入氯仿100ml，混合均匀后静置10-20分钟，溶液中的紫红色便会慢慢地析出并出分液漏斗的最下面，基上是纯绿的溶液，将下层的液体排出，再继续加入氯仿，如此反复3次左右，最后将下层的液体排净，便可获得纯净的甲基绿溶液。

Ⅲ.操作方法：

• ①恒温冷冻切片吹干及丙酮固定后或石蜡切片脱蜡后至蒸馏水。
  ②将切片置入孵育液中（37℃）孵育30-120分钟或以上。
  ③蒸馏水冲洗1分钟。
  ④2%硝酸钴水溶液孵育5分钟。
  ⑤蒸馏水洗1分钟。
  ⑥1%硫化铵处理1分钟。
  ⑦1%硫化铵处理1分钟。
  ⑧流水冲洗5分钟以上。
  ⑨常规脱水、透明并封固。

结果：细胞核：红色，碱性磷酸酶活性部位：黑色。

2.α磷酸萘酯法（α.naphthyl phosphate）

Ⅰ.孵育液的配制：

• α-磷酸萘酯钠（Sodium α-naphtyl phosphate）　　10mg
  0.2M　Tris缓冲液（PH10.0）
  固红TR（Fast red TR）

用缓冲液溶解α-磷酸萘酯钠，再加入固红TR，充分混合后过滤即用，该液的PH应调校在9.0-9.4间。

Ⅱ.操作方法：

• ①恒冷箱冰冻切片，将切片附贴于硅化的载玻片上，吹干后用冷丙酮固定5-10分钟。
  ②蒸馏水冲洗。
  ③用上述孵育切片（37℃）30-60分钟。
  ④蒸馏水洗。
  ⑤2%甲基绿（氯仿提练过）染1分钟。
  ⑥水洗。
  ⑦用甘油明胶封片。

结果：细胞核：绿色，碱性磷酸酶活性部位，灰红色。

Ⅲ.注意事项：

①孵育切片后如果酶的活性部位显色较淡，可延长孵育时间，但应仔细观察切片的背景，不要有其它非特异性的沉淀。

②如为石蜡切片，孵育时间可在5小时左右。

③重氮盐也可用固蓝B盐（Fast blue B salt）如果用这种酶的反应活性部为紫黑色，核的对比染色应改用核固红或中性红。

3.磷酸萘酯AS-TR（或AS-BI）法

N：N-二甲基甲酰胺（N：N－dimethyl fornamide） 10 ml

摩尔碳酸钠（Molar　sodium carbonate）2-6滴

蒸馏水　10ml

用二甲基甲酰胺溶解AS-BI，再加入蒸馏水，再加入重碳酸钠一直调校该液至PH8.0为止。然后再加入蒸馏水300ml，0.2M　Tris 缓冲液PH8.3　180ml，该液可贮存几个月。

c)孵育液的配制：

贮存液　10ml

固红TR 10mg

搅拌彻底溶解后，过滤，即刻使用。

Ⅱ.操作方法

• ①恒冷箱冷冻切片（同上法同样进行）
  ②蒸馏水洗
  ③孵育液于室温下孵育20-30分钟
  ④水洗
  ⑤用甲基绿染核1分钟
  ⑥流水洗
  ⑦用甘油明胶封固切片。

结果：细胞核：绿色，碱性磷酸酶活性部位呈红色。

Ⅲ.注意事项：

①调校孵育液时，应注意经常测PH值，不要使之过碱。

②该法反应较快，应注意不要过度孵育，以免产生背景沉淀。

七、酸、碱性磷酸酶的双染色法

Ⅰ:试剂及孵育液的配制看前面几法。

Ⅱ.操作步骤

• ①切片处理同前。
  ②蒸馏水洗，醋酸缓冲液洗1-2分钟。
  ③擦干切片多余的缓冲液，入孵育液中孵育（AS-TR或AS-BI。PH5.0）30-60分钟（37℃）。石蜡切片孵育3-5小时（37℃）。
  ④蒸馏水洗，Tris缓冲液（PH8.0）洗。
  ⑤摔干切片上的缓冲液，入孵育液中孵育（Gomori氏孵育液PH9.0-9.5）冰冻切片70分钟，石蜡切片3-5小时（37℃）。
  ⑥蒸馏水冲洗1分钟。
  ⑦2%硝酸钴处理5分钟。
  ⑧蒸馏水冲洗。
  ⑨1%硫化胺处理1分钟。
  ⑩水洗。
  （11）Harri氏苏木素染细胞核1-2分钟。
  （12）水洗5-10分钟。
  （13）常规脱水、透明、封固。

结果：酸性磷酸酶活性部位呈鲜红色，量少者呈淡粉红色；碱性磷酸酶活性部位呈黑色，细胞核核呈蓝色。

Ⅲ.注意事项：

①根据实验，双染色一定要先孵育酸性磷酸酶后，再孵育碱性磷酸酶。这是因为这两种酶都在各自的最适PH范围内才具有最佳活性。但是各种酶的活性受PH影响是不同的，偏酸碱处理对酶活性的影响是可逆的。

②在做酶的孵育的时间，必须做对照片，以排除出现假阳性。

③盐酸副品红和亚硝酸钠应于孵育前混合，混合后一次性用完，不能过多配制，已免浪费。

④切片透明时不要经过苯酚二甲苯的处理。

IV．临床应用：

①用于骨肉瘤的鉴别诊断：在骨肉瘤的病例中，碱性磷酸酶的增高明显。

②用于骨巨细胞瘤和破骨细胞瘤的鉴别。前者骨巨细胞瘤的瘤细胞含有丰富的酸性磷酸酶。