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酶组织化学(磷酸酶显示)

至今为止,已发现的酶有8000多种,至少有2500种有可能被应用。但应用组织化学显示的酶不多,仅有几十种至百余种。

酶是一切生物体内具有催化作用的特殊蛋白质,在细胞各个部位都有酶存在。由于酶在生物体内无处不在,因而要将其充分地显示出来,必须首先要了解酶的特性,方能做到制备和保护好酶的活性。

一、酶的作用特点

①高度催化效率。酶作为一种生物催化剂,比其它非酶催化反应快,如脲酶在PH7.0 20℃时,催化尿素水解比非催化反应快1014倍。

②高度专一性(或特异性)酶对其所催化的底物具有较严格的选择性,一种酶只作用于一类化合物或一定的化学键,以促进一定的化学变化,生成一定的产物。

二、影响酶活性的几种因素

①温度对酶的影响

酶反应需要一定的温度,但温度不是越高越好,是要有条件的,人体内多数酶的最适反应温度是在37℃左右,因而实验损伤中的温度都定在40℃以内,当温度升高至70℃以上时,就可以导致酶的变性、失活。另外,低温并不破坏酶的活性,根据这一点,许多研究用的材料,平常都保存在-70℃以上的温度,以保证日后的研究用。保存于低温的组化,恢复至室温后,便可用于检测酶的活性。

②机体供血对酶的影响

机体供血一经切断(如手术标本)就会造成对酶的影响,如细胞中的溶酶体酶,由于缺氧,细胞中包绕溶酶体酶的膜就会受到破坏而发生破裂,酶便可发生扩散。

③PH值的高低对酶的活性有影响。

在正常的情况下,各种酶都在各自的适宜的PH值中生活,如显示碱性磷酸酶时,孵育液中的最适PH值在9.5左右,而显示酸性磷酸酶时,其最适PH值则在5.0左右,虽然如此,但大部分的酶都有一个最适的PH7.0左右,高于或低于此范围将会影响酶的最高活性。

④底物深度对酶反应速度的影响

在酶组织化学中,当底物的浓度还没达到最高值时,其反应的速度与底物的浓度成正比,底物浓度愈高,其反应速度愈快,但当底物浓度达到所需的最高值时,其反应速度将趋于恒定。

⑤抑制剂对酶活性的影响

在酶反应过程中,加入某些试剂,造成对酶活性的下降或者终止酶的反应的称为抑制剂。抑制剂分为两大类:一类是不可逆性抑制剂,其主要形式是酶与抑制剂以共价键方式紧密结合,用透析法不易除去抑制剂,酶活性难于恢复。
另一类为可逆性抑制剂。当抑制剂与酶以非共价键结合后,用透析法可将抑制剂除去,使酶重新获得活性。

⑥激活剂对酶活性的影响

在酶反应的过程中,加入某些无机离子,使其活性增高,这类物质被称为激活剂。如检测碱性磷酸酶时,加入镁离子。这类物质有Mg2+、K+、Na+、Ca2+、Fe2+等。

三、酶的分类:

根据国际酶学会议1961年的分类,将所有的酶分为六大类。

四、酶组织化学检测时必须注意的问题:

五、酸性磷酸酶的显示

1.改良的Gomori’s硝酸铅法

Ⅰ. 操作方法:

(11)常规脱水、透明并封固。

结果:细胞核红色,酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色。

2.改良的Gomorc氏硝酸铅法

结果:细胞核红色,酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色。

Ⅱ. 孵育液的配制:

巴比妥醋酸缓冲液(PH5.0)  20ml

3%β-甘油磷酸钠       2ml

硝酸铅           24毫克

用巴比妥醋酸缓冲液溶解硝酸铅,然后再加入3%β-甘油磷酸钠,彻底混合后过滤,再测定其PH值,如不足或高于,都应调校至5.0。

Ⅲ.注意事项:

① 依据当今之条件,制备切片,都以恒冷箱冷冻切片为好。因该法制作酶的破坏较少,反应及显示时间可以大大节省。

② 如果采用的是丙酮固定的切片,由于制作切片破坏了许多酶的活性,因而孵育切片时时间需延长,但这往往也容易引起背景的染色,应特别注意。

③ 孵育液可以连续几次使用,但应注意液体的挥发,如挥发过于严重,可适当添加适量的蒸馏水。

3.萘酚AS-TR或AS-BI磷酸酯法

Ⅰ.溶液的配制:(Nachthol AS-TR or AS-BI phosphate)

a液:萘酚AS-TR(或AS-BI)磷酸酯  20mg

二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide) 2ml

b液:醋酸钠(Sodium acefate) 1.17g

巴比妥钠(Sodium barbitone) 2.94g

蒸馏水  凑足        100ml

c液:硝酸钠(Sodium nitrite)400mg

蒸馏水  10ml

d液:盐酸付品红贮存液

盐酸付品红(Pararosanilin hydrochloride)1g

蒸馏水  20ml

浓盐酸 5ml

E液:孵育液的配制

a液   0.5ml

b液   2.5ml

c液   0.4ml

d液   0.4ml

蒸馏水  6ml

注意:c液和d液相混合在一起并放置2分钟后再加入到其它液体中,这是染色能够成功的关键步骤之所在。

Ⅱ.操作步骤:

结果:酸必磷酸酶活性部位呈红色,核及背景呈绿色。

六、碱性磷酸酶的显示

1.Gomori氏钙钴法

反应原理:这是一种金属沉淀技术,酶水解底物β-甘油磷酸钠,使之产生磷酸离子,这种初级反应产物与钙离子发生反应,形成磷酸钙。进一步的用硝酸钴处理产生磷酸钴沉淀,这种产物此时用光镜是看不见的,必须进一步的处理,用稀释的硫化铵处理,使之形成一种可见的硫化钴的黑色沉淀物。

Ⅰ.孵育液的配制:

该液最后的PH应在9.0-9.4之间,如果没达到,应调校之。

Ⅱ.2%甲基绿的提纯

甲基绿属于二苯甲烷染料,在其结构上比甲基紫多一个甲基,当溶解时,溶液中由于甲基的存在,在大部分绿色的情况下,有少量的紫红色,使颜色不纯。为了获得纯绿色的染液,在配制溶液时,必须将杂色除去,氯仿的提纯将是为达染液纯绿的目的。具体做法是,取一分液漏斗,倒入配好的溶液100ml,再加入氯仿100ml,混合均匀后静置10-20分钟,溶液中的紫红色便会慢慢地析出并出分液漏斗的最下面,基上是纯绿的溶液,将下层的液体排出,再继续加入氯仿,如此反复3次左右,最后将下层的液体排净,便可获得纯净的甲基绿溶液。

Ⅲ.操作方法:

结果:细胞核:红色,碱性磷酸酶活性部位:黑色。

2.α磷酸萘酯法(α.naphthyl phosphate)

Ⅰ.孵育液的配制:

用缓冲液溶解α-磷酸萘酯钠,再加入固红TR,充分混合后过滤即用,该液的PH应调校在9.0-9.4间。

Ⅱ.操作方法:

结果:细胞核:绿色,碱性磷酸酶活性部位,灰红色。

Ⅲ.注意事项:

①孵育切片后如果酶的活性部位显色较淡,可延长孵育时间,但应仔细观察切片的背景,不要有其它非特异性的沉淀。

②如为石蜡切片,孵育时间可在5小时左右。

③重氮盐也可用固蓝B盐(Fast blue B salt)如果用这种酶的反应活性部为紫黑色,核的对比染色应改用核固红或中性红。

3.磷酸萘酯AS-TR(或AS-BI)法

N:N-二甲基甲酰胺(N:N-dimethyl fornamide) 10 ml

摩尔碳酸钠(Molar sodium carbonate)2-6滴

蒸馏水 10ml

用二甲基甲酰胺溶解AS-BI,再加入蒸馏水,再加入重碳酸钠一直调校该液至PH8.0为止。然后再加入蒸馏水300ml,0.2M Tris 缓冲液PH8.3 180ml,该液可贮存几个月。

c)孵育液的配制:

贮存液 10ml

固红TR 10mg

搅拌彻底溶解后,过滤,即刻使用。

Ⅱ.操作方法

结果:细胞核:绿色,碱性磷酸酶活性部位呈红色。

Ⅲ.注意事项:

①调校孵育液时,应注意经常测PH值,不要使之过碱。

②该法反应较快,应注意不要过度孵育,以免产生背景沉淀。

七、酸、碱性磷酸酶的双染色法

Ⅰ:试剂及孵育液的配制看前面几法。

Ⅱ.操作步骤

结果:酸性磷酸酶活性部位呈鲜红色,量少者呈淡粉红色;碱性磷酸酶活性部位呈黑色,细胞核核呈蓝色。

Ⅲ.注意事项:

①根据实验,双染色一定要先孵育酸性磷酸酶后,再孵育碱性磷酸酶。这是因为这两种酶都在各自的最适PH范围内才具有最佳活性。但是各种酶的活性受PH影响是不同的,偏酸碱处理对酶活性的影响是可逆的。

②在做酶的孵育的时间,必须做对照片,以排除出现假阳性。

③盐酸副品红和亚硝酸钠应于孵育前混合,混合后一次性用完,不能过多配制,已免浪费。

④切片透明时不要经过苯酚二甲苯的处理。

IV.临床应用:

①用于骨肉瘤的鉴别诊断:在骨肉瘤的病例中,碱性磷酸酶的增高明显。

②用于骨巨细胞瘤和破骨细胞瘤的鉴别。前者骨巨细胞瘤的瘤细胞含有丰富的酸性磷酸酶。


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