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细菌、真菌及病毒包涵体染色

细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物。它形体微小,结构简单,无典型的细胞核,只有核质,无核膜和模仁不进行有丝分裂,除核蛋白体外无其他细胞器,在生物学分类上属于原生生物界中的原核细胞型。

一、细菌的形态

细菌的种类很多,形态各异,但归纳起来,基本上只有三种形状,即球形、杆形和螺形。

二、细菌的基本结构

细菌由细胞壁、细胞膜、细胞浆和核质核成。细胞壁的主要成分为肽聚糖;细胞膜的主要成分为磷脂,细胞浆中的主要成分是水、蛋白质、核酸和脂类物;核质的主要成分为DNA。在病理技术中,与病理技术相关的是细菌的细胞壁,细胞壁上结构的变化是将其显示出来的关键。

三、细菌的特殊结构

细菌除了上述的基本结构以外,能够显示出各种细菌的特性和形状的是他的特殊结构,根据细菌的特殊结构,就可以辨认出不同种类的细菌素。它的特殊结构是鞭膜、鞭毛、菌毛、芽胞。

四、Warthin-Starry法显示幽门弯曲菌

(1)操作方法:

结果:胃腺上皮或腺腔内表面,胃幽门弯曲菌显示棕黄至棕黑色,HP可散在出现,也可成团出现,其余组织及背景显示棕黄*色。

五、甲苯胺蓝染色法

结果:在胃粘膜腺上皮表面,腺腔内均可见到幽门螺杆菌(HP),有的呈弯曲杆状或逗点状,HP可散在出现,也可成团聚集出现,这要根据不同病例而异。

试剂的配制:

称取0.1g甲苯胺蓝,溶于100ml 0.1M醋酸盐缓冲液中,置室温5天后,即可使用染液于室温下可保存3个月,若放于4℃冰箱则可保存半年左右,但该液的染色效果在早期为最佳,若染液存放时间较长,则染色偏淡,应适应延长染色时间。

试剂配制:

1、醋酸缓冲液(PH3.6)

2.1%硝酸银液

3.对苯二酚液

4. 明胶液

明胶加入缓冲液后,用热水液促其溶解,或者放入37℃培养箱中过夜,禁用明火直接加热,因其容易热糊。

5.2%硝酸银液

6.显影液

(3)注意事项:

1.所有用于本法中的浸染液,都须预热60℃。

2.该法最早应用于螺旋体的染色,1983年,我们应用此法于胃幽门弯曲菌的染色,获得成功,现在该法是染幽门弯曲菌的最好方法,虽然操作较为复杂,但效果最好,经与其它几种方法的对照证明,应用本法能获得最好结果。

3.如果显影时间过长,切片颜色过深,切片深黑一片,可用1%亚铁氰化钾处理切片。

4.临床应用

(1)用于胃幽门螺杆的显示

(2)用于莱姆病(lyme fisease)的诊断,莱姆病是由Borrelia burgdor feri螺旋体所致的一种多系统性疾病,镜下见血管周围以淋巴细胞为主的炎细胞浸润,也可有浆细胞和嗜酸性粒细胞,用Warthin-Starry银染法可显示。

六、Wade-Fite氏抗酸菌染色法

结果:麻风杆菌,结核杆菌呈鲜红色,细胞核蓝色。

试剂配制:

A液: 碱性品红 5 g

无水酒精 50ml

B液: 苯 酚 5 ml

蒸 馏 水 95ml

临用前取B液9ml加入A液1ml,混合均匀后,用滤纸直接滴于切片上。

注意事项:

1.应用的苯酚(石炭酸)品红液应分开贮存。临用前混合在一起,这样可保证每次染色所显示的细菌着色的鲜艳度,且可延长染液的寿命。

2.切片最好用硅化片,以增加切片的附贴度,以避免在用硫酸反复分化时导致切片的脱落。

3.切片采用松节油和汽油混合液脱蜡,是为了保存细菌的类脂质不受到破坏,但松节油和汽油脱蜡不如二甲苯,因此脱蜡时间应充分,如在冬天,脱蜡时间还需延长。

4.苯酚品红液容易发生沉淀,沉淀颗粒如果在切片上,就会影响读片的效果,染液用前必须过滤。

5.核染色时间不宜过长,染完后不须用酸性酒精分化,用酸性酒精可将已着染的红色脱去,导致染色的失败。同理,切片也不能经酒精脱水。

七、Grocott-Gomori氏六胺银改良法显示真菌

结果:星型隐球菌被染为深黑色,菌壁四周深黑,中间为空白区,背景为红色;曲菌的孢子和菌丝均被染为深黑色,孢子四周黑色,中间也为一空白区,菌丝呈多结节分布,呈45度角分枝,有的如散花状分布,其它菌丝显示黑色。

试剂的配制:

[Ⅰ] 氧化剂原液: 重铬酸钾 10克

硫酸 10ml

蒸馏水凑足100ml

先将重铬酸钾溶于少量蒸馏水中,再加硫酸,最后用蒸馏水凑足100ml。

临用前用淡原液配成工作液,即可使用。

[Ⅱ]六氨银工作液

5%硝酸银水溶液 2.5 ml

5%四硼酸钠水溶液 2.5 ml

3%乌铬托品水溶液 12.5 ml

蒸馏水 12.5 ml

先将蒸馏水与乌铬托品水溶液混合在一起,再加入硝酸银水溶液,此时将呈现乳白色,搅拌后即可消失,加入四硼酸钠水溶液后,即可使用。

注意事项:

1.该法的主要原理是利用铬酸氧化真菌菌壁的多糖化合物而暴露醛基,醛基将六胺银液中的银还原,成为黑色的金属银。如此,氧化切片成为类键,氧化切片可以有几种不同的方法:

①加热法(上述的方法)

②延时氧化法:即将氧化液稀释,配成2%或5%,然后于室温中氧化过夜。

③微波加热氧化法:将氧化液连同切片于微波炉中加热氧化10-20分钟。

2.浸染切片也可根据不同的种类,采取不同的方法,如加热法,延时法或微波加热法。但浸染程度是否足够,应在显微镜下观察。

八、六氨银法改良法显示组织胞浆菌

结果:组织胞浆菌呈黑色,菌体中央为空白区,于吞噬细胞内,呈现重叠拥挤,状如桑椹。背景为淡绿色或淡红色,视所应用的对比染色而定。

九.病毒包涵体染色法

(一) Macchiavello氏改良法显示SARS病毒包涵体

结果:SARS病毒包涵体于肺组织细胞浆内,呈鲜红色,细胞核呈蓝色。纤维蛋白渗出物呈粉红色,结缔组织呈蓝色。

(二) Giemsa法显示多种病毒包涵体。

结果:SARS病毒包涵体于肺细胞胞浆中呈现鲜红色;合胞病毒,巨细胞病毒包涵体于肺组织的细胞核内,在没有形成包涵体前呈鲜红色,形成包涵体后呈深紫色至蓝色。红血细胞显示绿色。

试剂的配制:

Giemsa粉 2.4g

甲醇 50ml

甘油 50ml

先将Giemsa粉溶于甲醇中,然后加入甘油,混合后放入50℃左右的烤箱中加入热助其彻底溶解。然后放于4℃冰箱中备用。临用时,取0.01PBS40mlGiemsa原液,即可使用。

(三)、Giemsa法显示海蓝组织细胞

I 试剂的配制

取0.01M的PBS(pH7.6)40ml,加入Giemsa原液1ml混合均匀后即可使用。

II 操作方案

结果:海蓝组织细胞胞浆可见到充满海蓝色小空泡,有的可见到海蓝色子颗粒。

注意事项:

(四)、伊红和甲基蓝显示合胞病毒和巨细胞病毒包涵体。

结果:合胞病毒和巨细胞病毒包涵体着染深蓝色或绿色。于细胞核内,胶原纤维着染浅蓝绿色。SARS病毒包涵体不着色。

十、小结

病毒非常微小,最小的约为20nm左右。因而用一般的光学显微镜是无法观察到它的,从病理技术的角度,也就无法对它们进行鉴定了。但是当它们进入机体,形成包涵体后,就可以根据它们的所在部位和形态,应用不同的特殊素对它们进行显示和确定。当然鉴定病毒主要还要靠电子显微镜和其它生化手段。如鉴定SARS病毒时,于电镜下可见部分扩张的滑面内池内有群集的,大小较一致的病毒颗粒,表面有细小的花冠状微粒,病毒颗粒大小约为70-90nm。上述所应用的几种不同的特殊染色方法,对已形成的几种病毒包涵体的显示,经反复实验证明,是比较好的方法。

病毒属于一类非细胞结构,无自主繁殖能力的微生物,它必须依所侵蚀所寄宿的宿主细胞提供高分子合成装置和能量,它的基本结构是由核酸和蛋白质构成,当它们被融合在一起形成一小体后,方能在光学显微镜下被观察到,这些小体依其属性存在于细胞的不同部位,这些小体通常被称为病毒包涵体。

病毒种类很多,由它侵蚀机体并形成包涵体的种类也有不同,经研究发现由两类物质所构成一类是由DNA所构成属于碱性,在HE染色过程时呈深蓝色,位于细胞核内,包涵体的四周为空白区,造成这种现象的主要原因是病毒为了保存自己而形成的,病毒包涵体形成需要四个阶段:一是侵入阶段,病毒通过吸附,穿入等手段进入细胞核,二是大量繁殖,复制并完全控制细胞核阶段,整个细胞核均匀一致的颗粒所覆盖;三是收缩防守,构筑堡垒的阶段,分散于整个细胞核中的病毒逐步收缩集中建立起自身的桥头堡,并将细胞核逐步挖空,此时细胞中的骨架被损坏,细胞逐步变形;四是包涵体完整成形阶段,此时细胞核中间有一独立的圆形小体,四周被挖空,跟细胞的其他部分没有联系,形如孤岛,由于它的构造特殊,与外界失去联系,因而治疗此类病毒的药物无法达到,导致药物治疗效果不佳。合胞病毒和巨细胞病毒等属于这一类病毒,它们由DNA构成,应用Macchiavello氏改良法显示其包涵体效果不好,应用Giemsa在PH7.6和9.5时效果好,应用伊红和甲基蓝显示效果也很不错。另一类病毒包涵体则由RNA所构成,呈嗜酸性,位于细胞浆中,在HE染色中包涵体呈淡粉红色,SARS病毒等属于这一类。它们的包涵体的形成也要经历几个阶段,即进入构筑堡垒和包涵体形成三个阶段。当它们以吸附等方式进入机体后,于细胞浆寄宿下来,为了不暴露自身和保护自己,除借用细胞中的装置复制病毒外,还分泌毒素,将周围的蛋白质融合,形成包涵体。至于为什么有的病毒进入细胞核有的病毒进入细胞浆的原因,目前尚不清楚。


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