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切片的普通染色-常规石蜡切片制作

普通染色又称常规染色或HE(Haematoxylin and eosin)染色。它是病理技术中最常用的一种方法,通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法,以达到准确,完整的病理诊断。

一、染色目的

病理学的所有切片,都必须通过一种以上的染料,通过各种不同的方法,将切片中各种不同的物质,在不同染液的作用下,将其显示出来,使之在光学显微镜下,能够完全的观看各种结构。例如,HE染色,好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构,细胞核着蓝黑色,细胞浆着粉红色,软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据,因此,染色技术也是病理技术中的重要组成部分,必须不断地总结,方能提高。如果染色不好,切片染色一团糟,红蓝不分,结构不清,层次不明,影响了镜下的观察,直接影响了临床诊断,染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。

二、染色的作用

1.化学作用:所有的染色液中,可把它们分为两种类型,一种为酸性,另一种为碱性酸性染料中有染色作用的为阴离子碱性染料中有染色作用的为阳离子,每个细胞也存在着两种物质,细胞核含的是酸性物质,细胞浆含的是碱性物质。在染色时,细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用,细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用,由于反应的部位不同,结果着色有异。

2.物理作用:在染色过程中,染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内,此时,因受分子的引力作用,色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度,因此就可显出来不同的颜色来。

一般来说,染色的学说还有许多,但说服力强的仅有上述两种。但不管怎么样解释,实际上完成的每一种染色,都与上述两种学说分不开,它们的作用是相辅相成,同时存在的。

三、染色方法及步骤

1.人工苏木素,伊红染色法(HE法)

结果:细胞核被染成深蓝黑色;细胞浆被染成粉红色;软骨及钙盐被染成蓝色;胶原纤维染成淡粉红色,嗜酸性细胞及嗜酸性颗粒呈鲜红色;弹力纤维呈淡粉红色;某些蛋白性物呈粉红色等。

染色时的注意事项:

(1)切片用二甲苯脱腊,应视不同的季节有不同的脱蜡时间,在夏天,室温较高,脱蜡较迅速,往往在2-3min就可脱蜡干净,二在冬季,时间应相对延长。

(2)切片在进入二甲苯前,可用电吹风吹切片,使切片上的蜡处于熔解状态,这样脱蜡较迅速,尤其是冬天,此法更可行。

(3)切片上的蜡一定要清除彻底干净,否则将影响染色,造成切片染色不均的现象。

(4)切片进行无水化处理,这一步骤,一是可增加切片的附帖,二是可延长苏木素的使用寿命。切片用二甲苯脱蜡后,不能直接水洗,因二甲苯不溶于水,必须经过酒精,酒精可溶解二甲苯,又能与水混合,按照以前教科书的要求,切片在整个染色过程中,都不要让其干燥。经过多年的实践及经验,笔者认为,切片用酒精将二甲苯彻底消除后,在进入苏木素染液前,可用电吹风吹干,这一步对于切片没有充分的烤片时间,对于血块等的切片来说,尤为重要,切片经此步骤,增加了附贴的牢固性,减少切片在染色过程中脱离载片的机会,保证了染色的成功率。另者,切片进入苏木素染液全无水,可保证了苏木素染液的浓度和PH值,延长其使用寿命。以往切片进入苏木素染液前,都须经水洗,每次染色,都带入不少的水分,稀释了苏木素染液的浓度,改变了它的PH值,使染液寿命缩短。

(5)切片无水化除了用电吹风外,还可用火烧,切片用90%酒精洗后,取出切片,用火轻烧,也可达到切片的无水化。火对切片有损害吗?否,经实验证明,切片火烧时最高温度为80℃左右,对切片没有影响。用火烧时必须彻底清除二甲苯,因为二甲苯燃烧时可产生浓烟,如果存留于切片,将会影响观察。当然,用火时应特别注意防火,因为病理技术室的大部分试剂都为易燃品。

(6)苏木素染液中的最佳染色时间,确切地回答还是比较困难的,因为各种组织都有不同的染色时间,核的染色时间从30sec至15min不等。对于核的染色,为了充分地显示各种核染色质,一定要过染,尤其对于初学者来说,更是如此。

(7)苏木素染液有多种,常规应用的通常为明矾苏木素,明矾苏木素又有Harris苏木素,Mayer’s苏木素,和Ehrish苏木素等

(8)盐酸酒精分化切片,浓度有0.25%,0.5%和1%根据各人的情况而使用。这一步主要是将过染的颜色及不该染的染色去除掉,这一步要掌握得当,必须靠经验,核的染色清楚与否靠分化这一招,分化过度,核染色淡,分化不足,核染色质一团,分不清。初学者应于显微镜下控制分化程度

(9)水洗蓝化,也可用温热水来促使切片蓝化,可用氨水,碳酸锂等化学药品来促蓝,虽然如此,自来水冲洗蓝化切片是最好的,这对于切片的保存较为有利。

(10)伊红酒精浓度有0.25%,0.5%和1%之分,根据各单位的情况而定。切片一放入伊红染液,即可马上着色,但是,要染好切片,必须染够染足时间。

(11)分化伊红须用浓度较高的酒精,以往伊红染色以后,用低浓度的酒精分化,洗去多余的染液,实践中发现低浓度的酒精褪色能力特强,如果掌握不好,染上的伊红,便会被褪去大部分。改用较高浓度酒精后,这种现象便不会出现。

(12)作为切片脱水剂的酒精,要经常更换,尤其是无水酒精,更要保持其无水性。否则切片脱水不干净,含有水份就会褪色。切片取出后,不能令其干涸,即刻进行下一步。

(13)碳酸二甲苯,对于南方地区来说,是一种很有用的试剂,碳酸吸水性强,用它可加强脱水,它是二甲苯与酒精之间的缓冲剂,切片经此试剂后更加透明和光亮。有人认为碳酸为一种弱酸,切片用它后可能会褪色,这种担心是多余的,切片褪色,最主要是切片本身含有水份所导致。根据我们的实验,82年的切片经碳酸处理后,17年来颜色仍然保持鲜艳就足以说明。

(14)二甲苯须换三次,以确保切片的透明度,这对于切片的观察和保存,都大有好处。

(15)封片时要做到:切片从二甲苯取出后,不使切片干涸。如果干涸,由于空气潮湿,封片时就保证不了切片的无水。如果切片上保留着一定量的二甲苯,二甲苯的特性不溶于水,它的存在使切片与空气隔开,切片无法跟潮湿空气接触,就可保证切片的无水,这时及时滴上中性树胶,切片就能完好地封好。

封片

封片二

(16)封片用的中性树胶,不能过稠,也不能过稀,过稠胶难以伸展开,并容易产生气泡,影响封片的速度。过稀是因胶中含过多的二甲苯,封完切片后,胶一收缩及二甲苯挥发,切片就不能被完全封盖上,这都影响切片的质量。

2、自动染色机染色方法及步骤

自动染色机应用于病理切片的染色是近几年的事情,目前国内仅有少数单位拥有自动染色机,南方医院自1997年引进英国Shandon公司研制的Varicstain TM xy多程序全自动染色机以来,已完成活检HE染色和脱落细胞染色。

自动染色机

自动染色机2

应用该机染片的优点

根据我们的应用情况,现将我们的染色程序列表如下:

自动染色机工作程序一览表


21(6+1)
10-30sec
15min
90%
6
30sec
95%
5
30sec
100%alc
4
30sec
100%alc
3
30sec
二甲苯
2
3min
二甲苯
1
5min

20
20sec
苏木素
7
10-15min
伊红
8
3min
90%alc
9
30sec
95%alc
10
30sec
95%alc30sec 100%alc30sec
盐酸酒精
19
10sec
二甲苯
18
2min
二甲苯
17
2min
二甲苯
16
1min
碳酸二甲苯
15
1min
100%alc
14
2min
100%alc
13
1min

注意事项

3.酒精灯加温快速染色法及步骤

该法可用于临床快速冰冻切片,快速石蜡及某些快速诊断的切片。它不象常规染色法那样,各种步骤都需要一定的时间。快速染色不但要求要快,而且染色质量要好,否则将给诊断造成困难。

①所有切片包括冰冻切片和石蜡切片都须用电吹风吹,使切片附贴牢固。石蜡切片还须经过快速脱蜡,切片经电吹风吹一定时间后约(1min左右),即刻浸入二甲苯,此可见成片的石蜡溶解于二甲苯中,取出切片再用电吹风吹,然后再浸入二甲苯,如此反复2-3次,石蜡即脱干净,酒精洗后,继用电吹风吹干。

②用滴管滴染苏木素染液于切片上,在酒精灯上加热染色。加热时要来回移动切片,不要在一个点上加热,否则染色不均匀,一点加热的地方容易将切片掀起来,导致切片脱离载片。当加热的苏木素染液有蒸汽出现时,即可停止染色(时间约为30sec-1min)。

③倾去余液,急洗,速分化,水洗。将切片浸入70℃左右的热水中返蓝约30sec-1min。

④速染伊红,切片浸入伊红液即可,后速往下酒精至切片封固,整个染色过程约4min左右,其结果与常规法同。

4.超声波快速染色法及步骤

①切片处理同3法①。

②用一小烧杯,将入苏木素染液,浸入超声波的工作范围内,开动超声波计时表30sec,染色即可完成。

③取出切片,速水洗,分化,浸入热水或于超声波工作范围内超声20sec,速染伊红直至封片。

结果同常规染色法

两种快速染色法染色时的注意事项:

①切片要附贴牢固,薄切片是很重要的,如果切片过厚,加热染色时,切片容易翻起脱离载片,导致染色失败。

②超声波快速染色原理见(超声波快速石蜡制作程序)。


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