普通染色又称常规染色或HE(Haematoxylin and eosin)染色。它是病理技术中最常用的一种方法,通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法,以达到准确,完整的病理诊断。
一、染色目的
病理学的所有切片,都必须通过一种以上的染料,通过各种不同的方法,将切片中各种不同的物质,在不同染液的作用下,将其显示出来,使之在光学显微镜下,能够完全的观看各种结构。例如,HE染色,好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构,细胞核着蓝黑色,细胞浆着粉红色,软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据,因此,染色技术也是病理技术中的重要组成部分,必须不断地总结,方能提高。如果染色不好,切片染色一团糟,红蓝不分,结构不清,层次不明,影响了镜下的观察,直接影响了临床诊断,染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。
二、染色的作用
1.化学作用:所有的染色液中,可把它们分为两种类型,一种为酸性,另一种为碱性。酸性染料中有染色作用的为阴离子;碱性染料中有染色作用的为阳离子,每个细胞也存在着两种物质,细胞核含的是酸性物质,细胞浆含的是碱性物质。在染色时,细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用,细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用,由于反应的部位不同,结果着色有异。
2.物理作用:在染色过程中,染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内,此时,因受分子的引力作用,色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度,因此就可显出来不同的颜色来。
一般来说,染色的学说还有许多,但说服力强的仅有上述两种。但不管怎么样解释,实际上完成的每一种染色,都与上述两种学说分不开,它们的作用是相辅相成,同时存在的。
三、染色方法及步骤
1.人工苏木素,伊红染色法(HE法)
结果:细胞核被染成深蓝黑色;细胞浆被染成粉红色;软骨及钙盐被染成蓝色;胶原纤维染成淡粉红色,嗜酸性细胞及嗜酸性颗粒呈鲜红色;弹力纤维呈淡粉红色;某些蛋白性物呈粉红色等。
染色时的注意事项:
(1)切片用二甲苯脱腊,应视不同的季节有不同的脱蜡时间,在夏天,室温较高,脱蜡较迅速,往往在2-3min就可脱蜡干净,二在冬季,时间应相对延长。
(2)切片在进入二甲苯前,可用电吹风吹切片,使切片上的蜡处于熔解状态,这样脱蜡较迅速,尤其是冬天,此法更可行。
(3)切片上的蜡一定要清除彻底干净,否则将影响染色,造成切片染色不均的现象。
(4)切片进行无水化处理,这一步骤,一是可增加切片的附帖,二是可延长苏木素的使用寿命。切片用二甲苯脱蜡后,不能直接水洗,因二甲苯不溶于水,必须经过酒精,酒精可溶解二甲苯,又能与水混合,按照以前教科书的要求,切片在整个染色过程中,都不要让其干燥。经过多年的实践及经验,笔者认为,切片用酒精将二甲苯彻底消除后,在进入苏木素染液前,可用电吹风吹干,这一步对于切片没有充分的烤片时间,对于血块等的切片来说,尤为重要,切片经此步骤,增加了附贴的牢固性,减少切片在染色过程中脱离载片的机会,保证了染色的成功率。另者,切片进入苏木素染液全无水,可保证了苏木素染液的浓度和PH值,延长其使用寿命。以往切片进入苏木素染液前,都须经水洗,每次染色,都带入不少的水分,稀释了苏木素染液的浓度,改变了它的PH值,使染液寿命缩短。
(5)切片无水化除了用电吹风外,还可用火烧,切片用90%酒精洗后,取出切片,用火轻烧,也可达到切片的无水化。火对切片有损害吗?否,经实验证明,切片火烧时最高温度为80℃左右,对切片没有影响。用火烧时必须彻底清除二甲苯,因为二甲苯燃烧时可产生浓烟,如果存留于切片,将会影响观察。当然,用火时应特别注意防火,因为病理技术室的大部分试剂都为易燃品。
(6)苏木素染液中的最佳染色时间,确切地回答还是比较困难的,因为各种组织都有不同的染色时间,核的染色时间从30sec至15min不等。对于核的染色,为了充分地显示各种核染色质,一定要过染,尤其对于初学者来说,更是如此。
(7)苏木素染液有多种,常规应用的通常为明矾苏木素,明矾苏木素又有Harris苏木素,Mayer’s苏木素,和Ehrish苏木素等。
(8)盐酸酒精分化切片,浓度有0.25%,0.5%和1%根据各人的情况而使用。这一步主要是将过染的颜色及不该染的染色去除掉,这一步要掌握得当,必须靠经验,核的染色清楚与否靠分化这一招,分化过度,核染色淡,分化不足,核染色质一团,分不清。初学者应于显微镜下控制分化程度。
(9)水洗蓝化,也可用温热水来促使切片蓝化,可用氨水,碳酸锂等化学药品来促蓝,虽然如此,自来水冲洗蓝化切片是最好的,这对于切片的保存较为有利。
(10)伊红酒精浓度有0.25%,0.5%和1%之分,根据各单位的情况而定。切片一放入伊红染液,即可马上着色,但是,要染好切片,必须染够染足时间。
(11)分化伊红须用浓度较高的酒精,以往伊红染色以后,用低浓度的酒精分化,洗去多余的染液,实践中发现低浓度的酒精褪色能力特强,如果掌握不好,染上的伊红,便会被褪去大部分。改用较高浓度酒精后,这种现象便不会出现。
(12)作为切片脱水剂的酒精,要经常更换,尤其是无水酒精,更要保持其无水性。否则切片脱水不干净,含有水份就会褪色。切片取出后,不能令其干涸,即刻进行下一步。
(13)碳酸二甲苯,对于南方地区来说,是一种很有用的试剂,碳酸吸水性强,用它可加强脱水,它是二甲苯与酒精之间的缓冲剂,切片经此试剂后更加透明和光亮。有人认为碳酸为一种弱酸,切片用它后可能会褪色,这种担心是多余的,切片褪色,最主要是切片本身含有水份所导致。根据我们的实验,82年的切片经碳酸处理后,17年来颜色仍然保持鲜艳就足以说明。
(14)二甲苯须换三次,以确保切片的透明度,这对于切片的观察和保存,都大有好处。
(15)封片时要做到:切片从二甲苯取出后,不使切片干涸。如果干涸,由于空气潮湿,封片时就保证不了切片的无水。如果切片上保留着一定量的二甲苯,二甲苯的特性不溶于水,它的存在使切片与空气隔开,切片无法跟潮湿空气接触,就可保证切片的无水,这时及时滴上中性树胶,切片就能完好地封好。
(16)封片用的中性树胶,不能过稠,也不能过稀,过稠胶难以伸展开,并容易产生气泡,影响封片的速度。过稀是因胶中含过多的二甲苯,封完切片后,胶一收缩及二甲苯挥发,切片就不能被完全封盖上,这都影响切片的质量。
2、自动染色机染色方法及步骤
自动染色机应用于病理切片的染色是近几年的事情,目前国内仅有少数单位拥有自动染色机,南方医院自1997年引进英国Shandon公司研制的Varicstain TM xy多程序全自动染色机以来,已完成活检HE染色和脱落细胞染色。
应用该机染片的优点
根据我们的应用情况,现将我们的染色程序列表如下:
自动染色机工作程序一览表
水 21(6+1) 10-30sec 15min |
90% 6 30sec |
95% 5 30sec |
100%alc 4 30sec |
100%alc 3 30sec |
二甲苯 2 3min |
二甲苯 1 5min |
水 20 20sec |
苏木素 7 10-15min |
伊红 8 3min |
90%alc 9 30sec |
95%alc 10 30sec |
95%alc30sec | 100%alc30sec |
盐酸酒精 19 10sec |
二甲苯 18 2min |
二甲苯 17 2min |
二甲苯 16 1min |
碳酸二甲苯 15 1min |
100%alc 14 2min |
100%alc 13 1min |
注意事项
3.酒精灯加温快速染色法及步骤
该法可用于临床快速冰冻切片,快速石蜡及某些快速诊断的切片。它不象常规染色法那样,各种步骤都需要一定的时间。快速染色不但要求要快,而且染色质量要好,否则将给诊断造成困难。
①所有切片包括冰冻切片和石蜡切片都须用电吹风吹,使切片附贴牢固。石蜡切片还须经过快速脱蜡,切片经电吹风吹一定时间后约(1min左右),即刻浸入二甲苯,此可见成片的石蜡溶解于二甲苯中,取出切片再用电吹风吹,然后再浸入二甲苯,如此反复2-3次,石蜡即脱干净,酒精洗后,继用电吹风吹干。
②用滴管滴染苏木素染液于切片上,在酒精灯上加热染色。加热时要来回移动切片,不要在一个点上加热,否则染色不均匀,一点加热的地方容易将切片掀起来,导致切片脱离载片。当加热的苏木素染液有蒸汽出现时,即可停止染色(时间约为30sec-1min)。
③倾去余液,急洗,速分化,水洗。将切片浸入70℃左右的热水中返蓝约30sec-1min。
④速染伊红,切片浸入伊红液即可,后速往下酒精至切片封固,整个染色过程约4min左右,其结果与常规法同。
4.超声波快速染色法及步骤
①切片处理同3法①。
②用一小烧杯,将入苏木素染液,浸入超声波的工作范围内,开动超声波计时表30sec,染色即可完成。
③取出切片,速水洗,分化,浸入热水或于超声波工作范围内超声20sec,速染伊红直至封片。
结果同常规染色法
两种快速染色法染色时的注意事项:
①切片要附贴牢固,薄切片是很重要的,如果切片过厚,加热染色时,切片容易翻起脱离载片,导致染色失败。
②超声波快速染色原理见(超声波快速石蜡制作程序)。